Америкийн химийн салбарын Нобелийн шагналт Кэри Муллис 74 насандаа Калифорнид таалал төгсөв. Түүний эхнэрийн хэлснээр нас барсан нь наймдугаар сарын 7-нд болсон. Үүний шалтгаан нь уушгины хатгалгааны улмаас зүрх, амьсгалын дутагдал юм.
ДНХ-ийн молекулыг нээсэн Жеймс Ватсон өөрөө биохимийн шинжлэх ухаанд оруулсан хувь нэмэр болон Нобелийн шагнал хүртсэн тухайгаа ярих болно.
Жэймс Ватсон, Эндрю Берри, Кевин Дэвис нарын номноос эшлэл
ДНХ. Генетикийн хувьсгалын түүх
Бүлэг 7. Хүний геном. Амьдралын хувилбар
...
Полимеразын гинжин урвалыг (ПГУ) 1983 онд Цетус компанид ажиллаж байсан биохимич Кэри Муллис зохион бүтээжээ. Энэ урвалын нээлт нь нэлээд гайхалтай байсан. Муллис хожим дурссан: “1983 оны 1993-р сарын нэг баасан гаригийн орой би ухаан алдаж байсан. Би жолооны ард, улаан модон ойн нутаг болох Хойд Калифорнид сарны гэрэлтсэн, тахир дутуу уулын замаар явж байлаа.” Ийм нөхцөлд л түүнд урам зориг орсон нь гайхалтай. Калифорниа мужийн хойд хэсэгт ойлголтыг сурталчлах тусгай замууд байдаггүй; Зүгээр л нэг удаа найз нь Муллисыг мөстсөн давхар замын хажуугаар болгоомжгүй хурдалж байхыг харсан бөгөөд энэ нь түүнд огтхон ч санаа зовсонгүй. Нэг найз нь Нью Йорк Таймс сонинд хэлэхдээ: "Муллис улаан мод мөргөж үхнэ гэж төсөөлж байсан. Тиймээс зам дагуу улаан мод ургахгүй л бол жолоо барьж явахдаа юунаас ч айдаггүй” гэв. Зам дагуу улаан мод байгаа нь Муллисыг анхаарлаа төвлөрүүлэхэд хүргэсэн бөгөөд энэ нь энд байв. Муллис XNUMX онд шинэ бүтээлээрээ химийн салбарт Нобелийн шагнал хүртэж байсан бөгөөд түүнээс хойш үйлдлээрээ бүр ч хачирхалтай болжээ. Жишээлбэл, тэрээр ДОХ нь ХДХВ-ийн халдвартай холбоогүй гэсэн ревизионист онолыг дэмжигч бөгөөд энэ нь түүний нэр хүндийг эрс унагаж, эмч нарын ажилд саад учруулсан юм.
ПГУ бол нэлээд энгийн хариу үйлдэл юм. Үүнийг хэрэгжүүлэхийн тулд бидэнд шаардлагатай ДНХ-ийн фрагментийн янз бүрийн хэлхээний эсрэг талын төгсгөлд нэмэлт, химийн нийлэгжүүлсэн хоёр праймер хэрэгтэй. Праймерууд нь нэг судалтай ДНХ-ийн богино хэсгүүд бөгөөд тус бүр нь 20 орчим суурь хос урттай байдаг. Праймеруудын онцлог нь олшруулах шаардлагатай ДНХ-ийн хэсгүүд, өөрөөр хэлбэл ДНХ-ийн загвартай тохирч байдаг.
(Зургийг дарж болно) Кари Муллис, ПГУ-ын зохион бүтээгч
ПГУ-ын өвөрмөц байдал нь загвар ба праймер, богино синтетик олигонуклеотидын хооронд нэмэлт цогцолбор үүсэхэд суурилдаг. Праймер бүр нь давхар судалтай загварын хэлхээний аль нэгэнд нэмэлт бөгөөд олшруулсан бүсийн эхлэл ба төгсгөлийг хязгаарладаг. Үнэн хэрэгтээ үүссэн "матриц" нь бүхэл бүтэн геном бөгөөд бидний зорилго бол түүнээс бидний сонирхсон хэсгүүдийг тусгаарлах явдал юм. Үүнийг хийхийн тулд ДНХ-ийн хэлхээг салгахын тулд хоёр хэлхээтэй ДНХ-ийн загварыг хэдэн минутын турш 95 ° C хүртэл халаана. ДНХ-ийн хоёр хэлхээ хоорондын устөрөгчийн холбоо тасарсан тул энэ үе шатыг денатураци гэж нэрлэдэг. Туузыг салгасны дараа праймеруудыг нэг судалтай загварт холбохын тулд температурыг бууруулна. ДНХ полимераз нь нуклеотидын гинжин хэлхээнд холбогдон ДНХ-ийн репликацийг эхлүүлдэг. ДНХ полимераз фермент нь праймерыг праймер эсвэл хуулбарлах жишээ болгон ашиглан загварын хэлхээг хуулбарладаг. Эхний мөчлөгийн үр дүнд бид тодорхой ДНХ-ийн хэсгийг хэд хэдэн удаа дараалан хоёр дахин ихэсгэдэг. Дараа нь бид энэ процедурыг давтана. Цикл бүрийн дараа бид зорилтот хэсгийг хоёр дахин их хэмжээгээр авдаг. Хорин таван ПГУ-ын мөчлөгийн дараа (өөрөөр хэлбэл хоёр цаг хүрэхгүй хугацаанд) бидний сонирхож буй ДНХ-ийн бүс нь анхныхаас 225 дахин их (өөрөөр хэлбэл бид үүнийг ойролцоогоор 34 сая удаа олшруулсан). Үнэн хэрэгтээ, оролтод бид праймер, загвар ДНХ, ДНХ полимеразын фермент ба чөлөөт суурийн A, C, G, T-ийн холимогийг хүлээн авсан бөгөөд тодорхой урвалын бүтээгдэхүүний хэмжээ (праймераар хязгаарлагддаг) экспоненциалаар нэмэгдэж, тоо "урт" ДНХ-ийн хуулбарууд нь шугаман байдаг тул урвалын бүтээгдэхүүнүүд давамгайлдаг.
Хүссэн ДНХ-ийн хэсгийг олшруулах: полимеразын гинжин урвал
ПГУ-ын эхний өдрүүдэд гол асуудал нь дараах байдалтай байсан: халаах-хөргөх мөчлөг бүрийн дараа ДНХ полимеразыг 95 хэмийн температурт идэвхгүйжүүлсэн тул урвалын холимогт нэмэх шаардлагатай байв. Тиймээс 25 мөчлөг бүрийн өмнө дахин нэмэх шаардлагатай болсон. Урвалын процедур нь харьцангуй үр ашиггүй, маш их цаг хугацаа, полимеразын фермент шаарддаг, материал нь маш үнэтэй байсан. Аз болж байгаль эх аварчээ. Олон амьтад 37 хэмээс дээш температурт тав тухтай байдаг. 37 ° C гэсэн үзүүлэлт яагаад бидний хувьд чухал болсон бэ? Энэ температур нь ПГУ-ын полимераз ферментийг анх гаргаж авсан E. coli-ийн хувьд оновчтой байдаг тул ийм зүйл болсон. Байгальд олон сая жилийн байгалийн шалгарлын явцад уураг нь өндөр температурт илүү тэсвэртэй болсон бичил биетүүд байдаг. Термофиль бактерийн ДНХ полимеразыг ашиглахыг санал болгов. Эдгээр ферментүүд нь халуунд тэсвэртэй, олон урвалын циклийг тэсвэрлэх чадвартай болсон. Тэдгээрийн хэрэглээ нь ПГУ-ыг хялбаршуулж, автоматжуулах боломжтой болсон. Анхны халуунд тэсвэртэй ДНХ полимеразуудын нэгийг Йеллоустоун үндэсний цэцэрлэгт хүрээлэнгийн халуун рашаанд амьдардаг Thermus aquaticus бактериас тусгаарлаж, Так полимераза гэж нэрлэжээ.
ПГУ нь хурдан хүний геномын төслийн гол хүч болсон. Ерөнхийдөө процесс нь Муллисийн боловсруулсан процессоос ялгаатай биш, дөнгөж автоматжуулсан. Хуванцар туршилтын хоолой руу шингэн дусал асгаж буй олон хараагүй төгсөх ангийн оюутнуудаас бид хараат байхаа больсон. Молекул генетикийн судалгаа хийдэг орчин үеийн лабораторид энэ ажлыг робот дамжуулагч дээр гүйцэтгэдэг. Хүний геном шиг том хэмжээний дараалал тогтоох төсөлд оролцож буй ПГУ-ын роботууд асар их хэмжээний халуунд тэсвэртэй полимеразаар тасралтгүй ажилладаг. Хүний геномын төсөл дээр ажиллаж байсан зарим эрдэмтэд ПГУ-ын патентын эзэн, Европын аж үйлдвэрийн эм зүйн аварга компани Хоффман-ЛаРош хэрэглээний материалын үнэд үндэслэлгүй өндөр роялти нэмсэнд дургүйцсэн.
Өөр нэг "хөдөлгөөний зарчим" нь ДНХ-ийн дарааллын арга юм. Энэ аргын химийн үндэс нь тухайн үед шинэ зүйл байхаа больсон: Улс хоорондын хүний геномын төсөл (HGP) нь 1970-аад оны дундуур Фред Сэнгерийн боловсруулсан нэгэн адил ухаалаг аргыг ашигласан. Инноваци нь дараалалд хүрч чадсан автоматжуулалтын цар хүрээ, зэрэгт оршдог.
Автомат дарааллыг анх Калифорнийн Технологийн Институтын Ли Худын лабораторид боловсруулсан. Тэрээр Монтана дахь ахлах сургуульд сурч, коллежийн хөлбөмбөг тоглож байсан; Hood-ийн ачаар тус баг улсын аваргад нэг бус удаа түрүүлсэн. Түүний багаар ажиллах чадвар нь шинжлэх ухааны карьерт нь бас тус болсон. Hood-ийн лабораторид химич, биологич, инженерүүдээс бүрдсэн алаг өнгийн баг ажиллаж байсан бөгөөд удалгүй түүний лаборатори технологийн шинэчлэлд тэргүүлэгч болжээ.
Үнэн хэрэгтээ автоматжуулсан дарааллын аргыг Ллойд Смит, Майк Хункапиллер нар зохион бүтээсэн. Тэр үед Hood-ийн лабораторид ажиллаж байсан Майк Хункапиллер Ллойд Смитэд хандаж, суурь бүрийг өөр өөр өнгөөр ялгах дараалал тогтоох аргыг сайжруулах санал тавьсан. Ийм санаа нь Сангерийн үйл явцын үр ашгийг дөрөв дахин нэмэгдүүлэх боломжтой. Сангерт ДНХ полимеразын оролцоотойгоор дөрвөн хоолой тус бүрт (суурийн тоогоор) дараалал хийх үед праймер дарааллыг багтаасан өөр өөр урттай олигонуклеотидын өвөрмөц багц үүсдэг. Дараа нь гинжийг салгах хоолойд формамид нэмж, дөрвөн эгнээнд полиакриламидын гель электрофорез хийсэн. Смит, Хункапиллер нарын хувилбарт дидеоксинуклеотидыг дөрвөн өөр будагч бодисоор тэмдэглэж, ПГУ-ыг нэг хуруу шилэнд хийдэг. Дараа нь полиакриламидын гель электрофорезын үед гель дээрх тодорхой байршилд байрлах лазер туяа нь будгийн идэвхийг өдөөдөг бөгөөд детектор нь гельээр аль нуклеотид шилжиж байгааг тодорхойлдог. Эхэндээ Смит гутранги үзэлтэй байсан - хэт бага тунгаар будагч бодис хэрэглэх нь нуклеотидын бүс нутгийг ялгах боломжгүй болно гэж айж байв. Гэсэн хэдий ч лазерын технологийн талаар маш сайн ойлголттой байсан тэрээр удалгүй лазерын цацраг туяанд өртөх үед флюресцент үүсгэдэг тусгай фторхром будагч бодис ашиглан нөхцөл байдлаас гарах арга замыг олжээ.
(Бүрэн хувилбар - 4,08 MB) Нарийн хэвлэх: Автомат дараалал тогтоох машинаас авсан автомат дараалал тогтоогч ашиглан ДНХ-ийн дараалал. Өнгө бүр дөрвөн суурийн аль нэгэнд тохирно
Сангер аргын сонгодог хувилбарт дүн шинжилгээ хийсэн ДНХ-ийн нэг хэлхээ нь ДНХ полимераза ферментийн нэмэлт хэлхээний нийлэгжилтийн загвар болж үйлчилдэг бөгөөд дараа нь ДНХ-ийн хэсгүүдийн дарааллыг хэмжээсээр нь гель болгон ангилдаг. Синтезийн явцад ДНХ-д багтаж, урвалын бүтээгдэхүүнийг дараа нь дүрслэх боломжийг олгодог фрагмент бүрийг терминалын суурьтай тохирох флюресцент будгаар тэмдэглэсэн байдаг (энэ тухай 124-р хуудсанд хэлэлцсэн); иймээс энэ фрагментийн флюресцент нь тухайн суурийн тодорхойлогч байх болно. Дараа нь зөвхөн урвалын бүтээгдэхүүнийг илрүүлж, дүрслэн харуулахад л үлддэг. Үр дүнг компьютерээр шинжилж, дөрвөн нуклеотидын тохирох олон өнгийн оргилуудын дарааллаар үзүүлэв. Дараа нь мэдээллийг компьютерийн мэдээллийн системд шууд дамжуулж, дараалал тогтооход маш их хүндрэл учруулдаг, цаг хугацаа их шаарддаг, заримдаа зовиуртай өгөгдөл оруулах процессыг арилгадаг.
» Номын талаарх дэлгэрэнгүй мэдээллийг эндээс авах боломжтой
»
»
Khabrozhiteley-ийн хувьд купон ашиглан 25% хөнгөлөлт - ПГУ
Эх сурвалж: www.habr.com