डीएनए पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शनचे शोधक नोबेल विजेते कॅरी मुलिस यांचे निधन झाले

रसायनशास्त्रातील नोबेल पारितोषिक विजेते अमेरिकन कॅरी मुलिस यांचे वयाच्या ७४ व्या वर्षी कॅलिफोर्नियामध्ये निधन झाले. पत्नीच्या म्हणण्यानुसार, मृत्यू 74 ऑगस्ट रोजी झाला. न्यूमोनियामुळे हृदय आणि श्वसन निकामी होणे हे कारण आहे.

स्वतः जेम्स वॉटसन, डीएनए रेणूचा शोध लावणारे, त्यांच्या बायोकेमिस्ट्रीतील योगदानाबद्दल आणि ज्यासाठी त्यांना नोबेल पारितोषिक मिळाले त्याबद्दल आम्हाला सांगतील.

जेम्स वॉटसन, अँड्र्यू बेरी, केविन डेव्हिस यांच्या पुस्तकातील उतारा

डीएनए. अनुवांशिक क्रांतीचा इतिहास

धडा 7. मानवी जीनोम. जीवन परिदृश्य

...
पॉलीमरेझ चेन रिएक्शन (पीसीआर) चा शोध 1983 मध्ये सेटस येथे काम करणार्‍या बायोकेमिस्ट कॅरी मुलिस यांनी लावला होता. या प्रतिक्रियेचा शोध खूपच उल्लेखनीय होता. मुलिस नंतर आठवते: “एप्रिल 1983 मध्ये एका शुक्रवारी संध्याकाळी, मला एक एपिफनी होती. उत्तर कॅलिफोर्निया, रेडवुडच्या जंगलांची भूमी असलेल्या पर्वतीय रस्त्यावरून मी चांदण्यांच्या मागे गाडी चालवत होतो.” अशा परिस्थितीतच प्रेरणा त्याच्यावर आली हे प्रभावी आहे. आणि असे नाही की उत्तर कॅलिफोर्नियामध्ये अंतर्दृष्टीला प्रोत्साहन देणारे विशेष रस्ते आहेत; फक्त त्याच्या मित्राने एकदा मुलिसला बर्फाळ ड्युअल कॅरेजवेवरून बेपर्वाईने वेगात जाताना पाहिले आणि त्याचा त्याला अजिबात त्रास झाला नाही. एका मित्राने न्यूयॉर्क टाईम्सला सांगितले: “मुलीसला एक दृष्टी होती की तो रेडवुडच्या झाडावर आदळून मरेल. त्यामुळे रस्त्याच्या कडेला लाल लाकडाची झाडे उगवल्याशिवाय त्याला गाडी चालवताना कशाचीही भीती वाटत नाही.” रस्त्याच्या कडेला असलेल्या रेडवूड्सच्या उपस्थितीने मुलिसला लक्ष केंद्रित करण्यास भाग पाडले आणि... येथे ही एक अंतर्दृष्टी होती. मुलिस यांना 1993 मध्ये त्यांच्या शोधासाठी रसायनशास्त्रातील नोबेल पारितोषिक मिळाले आणि तेव्हापासून ते त्यांच्या कृतींमध्ये आणखी अनोळखी झाले. उदाहरणार्थ, एड्सचा एचआयव्हीशी संबंध नाही या सुधारणावादी सिद्धांताचे ते समर्थक आहेत, ज्यामुळे त्यांची स्वतःची प्रतिष्ठा लक्षणीयरीत्या कमी झाली आणि डॉक्टरांमध्ये हस्तक्षेप झाला.

पीसीआर ही अगदी सोपी प्रतिक्रिया आहे. ते पार पाडण्यासाठी, आम्हाला दोन रासायनिक संश्लेषित प्राइमर्स आवश्यक आहेत जे आवश्यक DNA तुकड्यांच्या वेगवेगळ्या स्ट्रँडच्या विरुद्ध टोकांना पूरक आहेत. प्राइमर्स हे सिंगल-स्ट्रँडेड डीएनएचे छोटे विभाग असतात, प्रत्येकाची लांबी सुमारे 20 बेस जोड्या असते. प्राइमर्सचे वैशिष्ठ्य म्हणजे ते डीएनए विभागांशी सुसंगत आहेत ज्यांना विस्तारित करणे आवश्यक आहे, म्हणजेच डीएनए टेम्पलेट.

(प्रतिमा क्लिक करण्यायोग्य) कॅरी मुलिस, पीसीआरचा शोधकर्ता

पीसीआरची विशिष्टता टेम्पलेट आणि प्राइमर्स, शॉर्ट सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स दरम्यान पूरक कॉम्प्लेक्सच्या निर्मितीवर आधारित आहे. प्रत्येक प्राइमर दुहेरी-असरलेल्या टेम्प्लेटच्या एका स्ट्रँडला पूरक आहे आणि प्रवर्धित प्रदेशाची सुरुवात आणि शेवट मर्यादित करतो. खरं तर, परिणामी "मॅट्रिक्स" हा एक संपूर्ण जीनोम आहे आणि आमचा हेतू त्यापासून आम्हाला स्वारस्य असलेले तुकडे वेगळे करणे आहे. हे करण्यासाठी, DNA स्ट्रँड वेगळे करण्यासाठी दुहेरी-अडकलेले DNA टेम्पलेट 95 °C वर कित्येक मिनिटे गरम केले जाते. दोन डीएनए स्ट्रँडमधील हायड्रोजन बंध तुटल्यामुळे या अवस्थेला विकृतीकरण म्हणतात. स्ट्रँड वेगळे झाल्यानंतर, प्राइमरला सिंगल-स्ट्रँडेड टेम्प्लेटशी बांधता येण्यासाठी तापमान कमी केले जाते. डीएनए पॉलिमरेझ न्यूक्लियोटाइड साखळीला बांधून डीएनए प्रतिकृती सुरू करते. एन्झाइम डीएनए पॉलिमरेझ प्राइमर म्हणून प्राइमर किंवा कॉपी करण्यासाठी उदाहरण वापरून टेम्पलेट स्ट्रँडची प्रतिकृती बनवते. पहिल्या चक्राचा परिणाम म्हणून, आम्ही एका विशिष्ट DNA विभागाचे एकाधिक अनुक्रमिक दुप्पट प्राप्त करतो. पुढे आम्ही ही प्रक्रिया पुन्हा करतो. प्रत्येक चक्रानंतर आम्ही एक लक्ष्य क्षेत्र दुप्पट प्रमाणात मिळवतो. पंचवीस पीसीआर चक्रांनंतर (म्हणजे दोन तासांपेक्षा कमी वेळात), आमच्याकडे आमच्या आवडीचा डीएनए प्रदेश मूळपेक्षा 225 पट जास्त आहे (म्हणजे आम्ही ते अंदाजे 34 दशलक्ष वेळा वाढवले ​​आहे). खरं तर, इनपुटवर आम्हाला प्राइमर्स, टेम्पलेट डीएनए, डीएनए पॉलिमरेझ एन्झाइम आणि फ्री बेस ए, सी, जी आणि टी यांचे मिश्रण प्राप्त झाले, विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पादनाचे प्रमाण (प्राइमर्सद्वारे मर्यादित) वेगाने वाढते आणि " लांब” डीएनए प्रती रेषीय असतात, त्यामुळे प्रतिक्रिया उत्पादनांवर वर्चस्व असते.

इच्छित डीएनए विभागाचे प्रवर्धन: पॉलिमरेझ चेन प्रतिक्रिया

पीसीआरच्या सुरुवातीच्या दिवसांमध्ये, मुख्य समस्या खालीलप्रमाणे होती: प्रत्येक हीटिंग-कूलिंग सायकलनंतर, डीएनए पॉलिमरेझ प्रतिक्रिया मिश्रणात जोडणे आवश्यक होते, कारण ते 95 डिग्री सेल्सियस तापमानात निष्क्रिय होते. म्हणून, प्रत्येक 25 चक्रांपूर्वी ते पुन्हा जोडणे आवश्यक होते. प्रतिक्रिया प्रक्रिया तुलनेने अकार्यक्षम होती, बराच वेळ आणि पॉलिमरेज एन्झाइम आवश्यक होते आणि सामग्री खूप महाग होती. सुदैवाने, मदर निसर्ग बचावला आला. बरेच प्राणी 37 डिग्री सेल्सियसपेक्षा जास्त तापमानात आरामदायक वाटतात. ३७ डिग्री सेल्सिअस हा आकडा आपल्यासाठी महत्त्वाचा का झाला? असे घडले कारण हे तापमान E. coli साठी इष्टतम आहे, ज्यापासून PCR साठी पॉलिमरेझ एन्झाइम मूलतः प्राप्त केले गेले. निसर्गात असे सूक्ष्मजीव आहेत ज्यांचे प्रथिने, लाखो वर्षांच्या नैसर्गिक निवडीमुळे, उच्च तापमानास अधिक प्रतिरोधक बनले आहेत. थर्मोफिलिक बॅक्टेरियापासून डीएनए पॉलिमरेस वापरण्याचा प्रस्ताव आहे. हे एन्झाईम थर्मोस्टेबल बनले आणि अनेक प्रतिक्रिया चक्रांना तोंड देण्यास सक्षम होते. त्यांच्या वापरामुळे पीसीआर सुलभ आणि स्वयंचलित करणे शक्य झाले. यलोस्टोन नॅशनल पार्कच्या गरम पाण्याच्या झऱ्यांमध्ये राहणाऱ्या थर्मस अॅक्वाटिकस या जीवाणूपासून पहिल्या थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलिमरेसेसला वेगळे केले गेले आणि त्याला टाक पॉलिमरेझ असे नाव देण्यात आले.

PCR त्वरीत मानवी जीनोम प्रकल्पाचा वर्कहोर्स बनला. सर्वसाधारणपणे, ही प्रक्रिया मुलिसने विकसित केलेल्या प्रक्रियेपेक्षा वेगळी नाही, ती नुकतीच स्वयंचलित केली गेली आहे. आम्ही यापुढे मंदबुद्धीच्या पदवीधर विद्यार्थ्यांच्या गर्दीवर अवलंबून नव्हतो, जे कष्टपूर्वक प्लास्टिकच्या चाचणी ट्यूबमध्ये द्रवाचे थेंब ओततात. आण्विक अनुवांशिक संशोधन करणाऱ्या आधुनिक प्रयोगशाळांमध्ये, हे काम रोबोटिक कन्व्हेयरवर केले जाते. ह्युमन जीनोम सारख्या मोठ्या सीक्वेन्सिंग प्रोजेक्टमध्ये PCR रोबोट्स मोठ्या प्रमाणात उष्णता-स्थिर पॉलिमरेजसह अथकपणे काम करतात. मानवी जीनोम प्रकल्पावर काम करणारे काही शास्त्रज्ञ PCR पेटंट, युरोपियन औद्योगिक फार्मास्युटिकल दिग्गज हॉफमन-लारोचेच्या मालकाने उपभोग्य वस्तूंच्या किमतीत अवास्तव उच्च रॉयल्टी जोडल्यामुळे संतापले.

आणखी एक "ड्रायव्हिंग तत्त्व" म्हणजे डीएनए अनुक्रम पद्धती. या पद्धतीचा रासायनिक आधार त्या वेळी नवीन नव्हता: इंटरस्टेट ह्युमन जीनोम प्रोजेक्ट (HGP) ने 1970 च्या दशकाच्या मध्यात फ्रेड सेंगरने विकसित केलेली तीच कल्पक पद्धत स्वीकारली. ऑटोमेशनच्या स्केल आणि डिग्रीमध्ये नावीन्य होते जे अनुक्रम साध्य करण्यात सक्षम होते.

कॅलिफोर्निया इन्स्टिट्यूट ऑफ टेक्नॉलॉजीच्या ली हूडच्या प्रयोगशाळेत ऑटोमेटेड सिक्वेन्सिंग मूलतः विकसित केले गेले. त्याने मोंटानामधील हायस्कूलमध्ये शिक्षण घेतले आणि क्वार्टरबॅक म्हणून महाविद्यालयीन फुटबॉल खेळला; हूडचे आभार, संघाने एकापेक्षा जास्त वेळा राज्य चॅम्पियनशिप जिंकली. त्यांच्या वैज्ञानिक कारकिर्दीत त्यांच्या टीमवर्क कौशल्याचाही उपयोग झाला. हूडच्या प्रयोगशाळेत केमिस्ट, जीवशास्त्रज्ञ आणि अभियंते यांच्या मोटली क्रू द्वारे कर्मचारी होते आणि त्यांची प्रयोगशाळा लवकरच तांत्रिक नवकल्पनांमध्ये अग्रेसर बनली.

खरं तर, स्वयंचलित अनुक्रम पद्धतीचा शोध लॉयड स्मिथ आणि माईक हंकपिलर यांनी लावला होता. माईक हंकपिलर, हूडच्या प्रयोगशाळेत काम करत होते, त्यांनी लॉयड स्मिथ यांच्याशी एका सुधारित अनुक्रम पद्धतीचा प्रस्ताव मांडला ज्यामध्ये प्रत्येक प्रकारच्या बेसचा रंग वेगळा असेल. अशी कल्पना सेंगर प्रक्रियेची कार्यक्षमता चौपट करू शकते. सेंगरमध्ये, प्रत्येक चार नलिकांमध्ये (बेसच्या संख्येनुसार) अनुक्रम करताना, डीएनए पॉलिमरेजच्या सहभागासह, प्राइमर अनुक्रमासह, वेगवेगळ्या लांबीच्या ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्सचा एक अद्वितीय संच तयार होतो. पुढे, साखळी विभक्त करण्यासाठी फॉर्मॅमाइड ट्यूबमध्ये जोडले गेले आणि पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस चार लेनवर केले गेले. स्मिथ आणि हंकापिलरच्या आवृत्तीमध्ये, डिडिओक्सिन्युक्लियोटाइड्सला चार वेगवेगळ्या रंगांनी लेबल केले जाते आणि पीसीआर एका ट्यूबमध्ये केले जाते. नंतर, पॉलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसीस दरम्यान, जेलवरील विशिष्ट ठिकाणी लेसर बीम रंगांच्या क्रियाकलापांना उत्तेजित करते आणि डिटेक्टर निर्धारित करतो की सध्या जेलमधून कोणते न्यूक्लियोटाइड स्थलांतरित आहे. सुरुवातीला, स्मिथ निराशावादी होता - त्याला भीती वाटली की डाईच्या अति-कमी डोसचा वापर केल्याने न्यूक्लियोटाइड क्षेत्र वेगळे केले जातील. तथापि, लेसर तंत्रज्ञानाची उत्कृष्ट समज असल्यामुळे, लेसर किरणोत्सर्गाच्या संपर्कात आल्यावर फ्लोरोस करणारे विशेष फ्लोरोक्रोम रंग वापरून त्यांनी लवकरच परिस्थितीतून बाहेर पडण्याचा मार्ग शोधला.

(संपूर्ण आवृत्ती क्लिक करून - 4,08 MB) फाइन प्रिंट: डीएनए सीक्वेन्स ऑटोमॅटिक सिक्वेन्सरचा वापर करून, ऑटोमॅटिक सिक्वेन्सिंग मशीनमधून मिळवला जातो. प्रत्येक रंग चारपैकी एका पायाशी संबंधित असतो

सेंगर पद्धतीच्या क्लासिक आवृत्तीमध्ये, विश्लेषित डीएनएच्या स्ट्रँडपैकी एक एंझाइम डीएनए पॉलिमरेझद्वारे पूरक स्ट्रँडच्या संश्लेषणासाठी टेम्पलेट म्हणून कार्य करते, त्यानंतर डीएनए तुकड्यांचा क्रम आकारानुसार जेलमध्ये क्रमवारी लावला जातो. प्रत्येक तुकडा, जो संश्लेषणादरम्यान डीएनएमध्ये समाविष्ट केला जातो आणि त्यानंतरच्या प्रतिक्रिया उत्पादनांच्या व्हिज्युअलायझेशनला परवानगी देतो, टर्मिनल बेसशी संबंधित फ्लोरोसेंट डाईने लेबल केले जाते (याची चर्चा पृष्ठ 124 वर केली होती); म्हणून, या तुकड्याचा फ्लूरोसेन्स दिलेल्या बेससाठी ओळखकर्ता असेल. मग जे उरते ते शोधणे आणि प्रतिक्रिया उत्पादनांची कल्पना करणे. परिणामांचे संगणकाद्वारे विश्लेषण केले जाते आणि चार न्यूक्लियोटाइड्सशी संबंधित बहु-रंगीत शिखरांचा क्रम म्हणून सादर केले जाते. नंतर माहिती थेट संगणकाच्या माहिती प्रणालीवर हस्तांतरित केली जाते, वेळ घेणारी आणि कधीकधी वेदनादायक डेटा एंट्री प्रक्रिया काढून टाकते ज्यामुळे अनुक्रम करणे खूप कठीण होते.

» पुस्तकाबद्दल अधिक तपशील येथे आढळू शकतात प्रकाशकाची वेबसाइट
» सामग्री सारणी
» उतारा

Khabrozhiteley साठी कूपन वापरून 25% सूट - पीसीआर

स्त्रोत: www.habr.com