Pemenang Nobel Amerika dalam bidang kimia Kary Mullis meninggal dunia di California pada usia 74 tahun. Menurut isterinya, kematian berlaku pada 7 Ogos. Puncanya adalah kegagalan jantung dan pernafasan akibat radang paru-paru.
James Watson sendiri, penemu molekul DNA, akan memberitahu kita tentang sumbangannya kepada biokimia dan yang mana dia menerima Hadiah Nobel.
Petikan dari buku oleh James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Sejarah Revolusi Genetik
Bab 7. Genom manusia. Senario kehidupan
...
Tindak balas rantai polimerase (PCR) telah dicipta pada tahun 1983 oleh ahli biokimia Carey Mullis, yang bekerja di Cetus. Penemuan reaksi ini agak luar biasa. Mullis kemudiannya teringat: βPada suatu petang Jumaat pada April 1983, saya mengalami pencerahan. Saya berada di belakang kemudi, memandu menyusuri jalan gunung yang diterangi cahaya bulan dan berliku di California Utara, tanah hutan kayu merah.β Sungguh mengagumkan bahawa dalam keadaan seperti itu inspirasi melandanya. Dan bukan kerana California utara mempunyai jalan khas yang menggalakkan wawasan; cuma rakannya pernah melihat Mullis memecut secara melulu di sepanjang jalan dua jalan yang berais dan ia langsung tidak mengganggunya. Seorang rakan memberitahu New York Times: "Mullis mempunyai penglihatan bahawa dia akan mati dengan merempuh pokok kayu merah. Oleh itu, dia tidak takut apa-apa semasa memandu, melainkan ada pokok merah yang tumbuh di sepanjang jalan." Kehadiran kayu merah di sepanjang jalan memaksa Mullis untuk menumpukan perhatian dan... ini dia, satu pandangan. Mullis menerima Hadiah Nobel dalam Kimia untuk ciptaannya pada tahun 1993 dan sejak itu menjadi lebih asing dalam tindakannya. Sebagai contoh, beliau adalah penyokong teori revisionis bahawa AIDS tidak berkaitan dengan HIV, yang secara ketara menjejaskan reputasinya sendiri dan mengganggu doktor.
PCR adalah tindak balas yang agak mudah. Untuk melaksanakannya, kita memerlukan dua primer yang disintesis secara kimia yang merupakan pelengkap kepada hujung bertentangan bagi helai berbeza serpihan DNA yang diperlukan. Primer ialah bahagian pendek DNA untai tunggal, setiap satu kira-kira 20 pasangan asas panjangnya. Keanehan primer ialah ia sesuai dengan bahagian DNA yang perlu dikuatkan, iaitu templat DNA.
(Imej boleh diklik) Kary Mullis, pencipta PCR
Kekhususan PCR adalah berdasarkan pembentukan kompleks pelengkap antara templat dan primer, oligonukleotida sintetik pendek. Setiap primer adalah pelengkap kepada salah satu helai templat beruntai dua dan mengehadkan permulaan dan penghujung kawasan yang dikuatkan. Sebenarnya, "matriks" yang terhasil ialah genom keseluruhan, dan matlamat kami adalah untuk mengasingkan serpihan yang menarik kepada kami daripadanya. Untuk melakukan ini, templat DNA untai dua dipanaskan hingga 95 Β°C selama beberapa minit untuk memisahkan untaian DNA. Peringkat ini dipanggil denaturasi kerana ikatan hidrogen antara dua helai DNA terputus. Sebaik sahaja helai telah dipisahkan, suhu diturunkan untuk membolehkan primer mengikat pada templat beruntai tunggal. Polimerase DNA memulakan replikasi DNA dengan mengikat rantaian nukleotida. Enzim DNA polimerase mereplikasi helai templat menggunakan primer sebagai primer atau contoh untuk menyalin. Hasil daripada kitaran pertama, kami memperoleh penggandaan berbilang urutan bagi bahagian DNA tertentu. Seterusnya kita ulangi prosedur ini. Selepas setiap kitaran kita memperoleh kawasan sasaran dalam kuantiti berganda. Selepas dua puluh lima kitaran PCR (iaitu, dalam masa kurang daripada dua jam), kita mempunyai kawasan DNA yang menarik minat kita dalam jumlah 225 kali lebih tinggi daripada yang asal (iaitu, kita telah menguatkannya kira-kira 34 juta kali). Malah, pada input kami menerima campuran primer, DNA templat, enzim DNA polimerase dan bes bebas A, C, G dan T, jumlah produk tindak balas tertentu (terhad oleh primer) berkembang dengan pesat, dan bilangan salinan DNA "panjang" adalah linear, jadi dalam produk tindak balas mendominasi.
Penguatan bahagian DNA yang dikehendaki: tindak balas rantai polimerase
Pada hari-hari awal PCR, masalah utama adalah yang berikut: selepas setiap kitaran pemanasan-penyejukan, polimerase DNA perlu ditambah kepada campuran tindak balas, kerana ia tidak diaktifkan pada suhu 95 Β° C. Oleh itu, adalah perlu untuk menambahnya semula sebelum setiap 25 kitaran. Prosedur tindak balas adalah agak tidak cekap, memerlukan banyak masa dan enzim polimerase, dan bahannya sangat mahal. Nasib baik, Ibu Alam datang untuk menyelamatkan. Banyak haiwan berasa selesa pada suhu lebih tinggi daripada 37 Β°C. Mengapakah angka 37 Β°C menjadi penting bagi kita? Ini berlaku kerana suhu ini adalah optimum untuk E. coli, dari mana enzim polimerase untuk PCR pada asalnya diperolehi. Di alam semula jadi terdapat mikroorganisma yang proteinnya, selama berjuta-juta tahun pemilihan semula jadi, telah menjadi lebih tahan terhadap suhu tinggi. Ia telah dicadangkan untuk menggunakan polimerase DNA daripada bakteria termofilik. Enzim-enzim ini ternyata termostable dan mampu menahan banyak kitaran tindak balas. Penggunaannya memungkinkan untuk memudahkan dan mengautomasikan PCR. Salah satu polimerase DNA termostabil pertama telah diasingkan daripada bakteria Thermus aquaticus, yang tinggal di mata air panas Taman Negara Yellowstone, dan dinamakan Taq polymerase.
PCR dengan cepat menjadi tenaga kerja Projek Genom Manusia. Secara umum, proses ini tidak berbeza dengan yang dibangunkan oleh Mullis, ia baru sahaja diautomatikkan. Kami tidak lagi bergantung kepada sekumpulan pelajar siswazah yang kurang akal yang bersusah payah menuangkan titisan cecair ke dalam tabung uji plastik. Di makmal moden yang menjalankan penyelidikan genetik molekul, kerja ini dilakukan pada penghantar robot. Robot PCR yang terlibat dalam projek penjujukan sebesar Genom Manusia bekerja tanpa henti dengan jumlah besar polimerase stabil haba. Beberapa saintis yang bekerja pada Projek Genom Manusia berasa marah dengan royalti yang tidak munasabah yang ditambah kepada kos bahan habis pakai oleh pemilik paten PCR, gergasi farmaseutikal perindustrian Eropah Hoffmann-LaRoche.
Satu lagi "prinsip pemanduan" ialah kaedah penjujukan DNA itu sendiri. Asas kimia kaedah ini bukan lagi baru pada masa itu: Projek Genom Manusia Antara Negeri (HGP) menggunakan kaedah cerdik yang sama yang telah dibangunkan oleh Fred Sanger pada pertengahan 1970-an. Inovasi terletak pada skala dan tahap automasi yang mampu dicapai oleh penjujukan.
Penjujukan automatik pada asalnya dibangunkan di makmal Lee Hood di Institut Teknologi California. Dia menghadiri sekolah menengah di Montana dan bermain bola sepak kolej sebagai quarterback; Terima kasih kepada Hood, pasukan itu memenangi kejohanan negeri lebih daripada sekali. Kemahiran kerja berpasukannya juga berguna dalam kerjaya saintifiknya. Makmal Hood dikendalikan oleh kru beraneka ragam ahli kimia, ahli biologi dan jurutera, dan makmalnya tidak lama kemudian menjadi peneraju dalam inovasi teknologi.
Malah, kaedah penjujukan automatik telah dicipta oleh Lloyd Smith dan Mike Hunapilller. Mike Hunkapiller, ketika itu bekerja di makmal Hood, mendekati Lloyd Smith dengan cadangan untuk kaedah penjujukan yang lebih baik di mana setiap jenis asas akan diwarnakan secara berbeza. Idea sedemikian boleh menggandakan kecekapan proses Sanger. Di Sanger, apabila penjujukan dalam setiap empat tiub (mengikut bilangan bes), dengan penyertaan polimerase DNA, satu set unik oligonukleotida dengan panjang yang berbeza terbentuk, termasuk urutan primer. Seterusnya, formamide telah ditambah ke dalam tiub untuk pemisahan rantai dan elektroforesis gel poliakrilamida dilakukan pada empat lorong. Dalam versi Smith dan Hunkapiller, dideoxynucleotides dilabelkan dengan empat pewarna berbeza dan PCR dilakukan dalam satu tiub. Kemudian, semasa elektroforesis gel poliakrilamida, pancaran laser di lokasi tertentu pada gel merangsang aktiviti pewarna, dan pengesan menentukan nukleotida yang sedang berhijrah melalui gel. Pada mulanya, Smith bersikap pesimis - dia bimbang menggunakan pewarna dengan dos ultra rendah akan menyebabkan kawasan nukleotida tidak dapat dibezakan. Walau bagaimanapun, mempunyai pemahaman yang sangat baik tentang teknologi laser, dia tidak lama lagi menemui jalan keluar daripada situasi itu dengan menggunakan pewarna fluorochrome khas yang berpendar apabila terdedah kepada sinaran laser.
(Versi penuh - 4,08 MB) Cetakan halus: Jujukan DNA disusun menggunakan penjujukan automatik, diperoleh daripada mesin penjujukan automatik. Setiap warna sepadan dengan satu daripada empat asas
Dalam versi klasik kaedah Sanger, salah satu helai DNA yang dianalisis bertindak sebagai templat untuk sintesis untaian pelengkap oleh enzim DNA polimerase, kemudian urutan serpihan DNA diisih dalam gel mengikut saiz. Setiap serpihan yang dimasukkan ke dalam DNA semasa sintesis dan membenarkan visualisasi produk tindak balas seterusnya dilabelkan dengan pewarna pendarfluor sepadan dengan pangkalan terminal (ini telah dibincangkan pada ms 124); oleh itu, pendarfluor serpihan ini akan menjadi pengecam bagi asas tertentu. Kemudian yang tinggal hanyalah melakukan pengesanan dan memvisualisasikan produk tindak balas. Keputusan dianalisis oleh komputer dan dibentangkan sebagai jujukan puncak pelbagai warna sepadan dengan empat nukleotida. Maklumat tersebut kemudiannya dipindahkan terus ke sistem maklumat komputer, menghapuskan proses kemasukan data yang memakan masa dan kadangkala menyakitkan yang menjadikan penjujukan sangat sukar.
Β» Butiran lanjut tentang buku boleh didapati di
Β»
Β»
Untuk Khabrozhiteley diskaun 25% menggunakan kupon - PCR
Sumber: www.habr.com