डिएनए पोलिमरेज चेन रियाक्सनका आविष्कारक नोबेल पुरस्कार विजेता क्यारी मुलिसको निधन भएको छ

रसायनशास्त्रमा नोबेल पुरस्कार विजेता अमेरिकी क्यारी मुलिसको ७४ वर्षको उमेरमा क्यालिफोर्नियामा निधन भएको छ । उनकी श्रीमतीका अनुसार मृत्यु भदौ ७ गते भएको हो । कारण निमोनियाको कारण मुटु र श्वासप्रश्वासको विफलता हो।

जेम्स वाट्सन आफैं, डीएनए अणुको आविष्कारक, हामीलाई जैविक रसायनमा उनको योगदानको बारेमा बताउनेछन् र जसको लागि उनले नोबेल पुरस्कार प्राप्त गरे।

जेम्स वाटसन, एन्ड्रयू बेरी, केविन डेभिस द्वारा पुस्तक को अंश

DNA। आनुवंशिक क्रान्तिको इतिहास

अध्याय 7. मानव जीनोम। जीवन परिदृश्य

...
पोलिमरेज चेन रियाक्सन (PCR) सन् १९८३ मा Cetus मा काम गर्ने बायोकेमिस्ट केरी मुलिसले आविष्कार गरेका थिए। यो प्रतिक्रिया को खोज धेरै उल्लेखनीय थियो। मुलिसले पछि सम्झना गरे: "अप्रिल 1983 मा एक शुक्रबार साँझ, मेरो एपिफेनी थियो। म उत्तरी क्यालिफोर्निया, रेडवुड जङ्गलहरूको भूमिमा चन्द्रमाको उज्यालो, घुमाउरो पहाडी सडकमा हिड्दै थिएँ। यो प्रभावशाली छ कि यो यस्तो अवस्थामा थियो कि प्रेरणाले उनलाई प्रहार गर्यो। र यो होइन कि उत्तरी क्यालिफोर्नियामा विशेष सडकहरू छन् जसले अन्तरदृष्टिलाई बढावा दिन्छ; यो मात्र हो कि उसको साथीले एक पटक मुलिसलाई बरफको दोहोरो क्यारेजवेमा लापरवाह गतिमा हिडिरहेको देख्यो र यसले उसलाई कुनै चिन्ता गरेन। एक साथीले न्यु योर्क टाइम्सलाई भने: “मुलिसको सपना थियो कि ऊ रेडवुडको रूखमा ठोक्किएर मर्नेछ। त्यसैले सडक छेउमा रातो काठका रूखहरू नहुदासम्म उसलाई गाडी चलाउँदा कुनै कुराको डर लाग्दैन ।” सडकको छेउमा रेडवुडहरूको उपस्थितिले मुलिसलाई ध्यान केन्द्रित गर्न बाध्य तुल्यायो र ... यहाँ यो एक अन्तरदृष्टि थियो। मुलिसले 1983 मा आफ्नो आविष्कारको लागि रसायनशास्त्रमा नोबेल पुरस्कार प्राप्त गरे र त्यसपछि उनको कार्यमा अझ अपरिचित बने। उदाहरणका लागि, उनी एड्स एचआईभीसँग सम्बन्धित छैन भन्ने संशोधनवादी सिद्धान्तका समर्थक हुन्, जसले उनको आफ्नै प्रतिष्ठालाई उल्लेखनीय रूपमा कमजोर बनायो र डाक्टरहरूसँग हस्तक्षेप गर्‍यो।

PCR एकदम सरल प्रतिक्रिया हो। यसलाई पूरा गर्न, हामीलाई आवश्यक DNA टुक्राको विभिन्न स्ट्र्यान्डहरूको विपरीत छेउमा पूरक हुने दुई रासायनिक संश्लेषित प्राइमरहरू चाहिन्छ। प्राइमरहरू सिंगल-स्ट्र्यान्डेड DNA को छोटो खण्डहरू हुन्, प्रत्येक लम्बाइमा लगभग 20 आधार जोडीहरू। प्राइमरहरूको विशेषता यो हो कि तिनीहरू डीएनए खण्डहरूसँग मेल खान्छ जुन एम्प्लीफाइड गर्न आवश्यक छ, त्यो हो, डीएनए टेम्प्लेट।

(छवि क्लिक गर्न सकिने) क्यारी मुलिस, PCR का आविष्कारक

PCR को विशिष्टता टेम्प्लेट र प्राइमरहरू, छोटो सिंथेटिक ओलिगोन्यूक्लियोटाइडहरू बीचको पूरक परिसरहरूको गठनमा आधारित छ। प्रत्येक प्राइमरहरू डबल-स्ट्र्यान्ड टेम्प्लेटको एक स्ट्र्यान्डको पूरक हो र विस्तारित क्षेत्रको सुरु र अन्त्यलाई सीमित गर्दछ। वास्तवमा, नतिजा "म्याट्रिक्स" एक सम्पूर्ण जीनोम हो, र हाम्रो लक्ष्य यसबाट हामीलाई चासोका टुक्राहरू अलग गर्नु हो। यो गर्नको लागि, डबल-स्ट्र्यान्डेड डीएनए टेम्प्लेटलाई डीएनए स्ट्र्यान्डहरू अलग गर्न धेरै मिनेटको लागि 95 डिग्री सेल्सियसमा तताइन्छ। दुई DNA स्ट्र्यान्डहरू बीचको हाइड्रोजन बन्डहरू भाँचिएको हुनाले यस चरणलाई विकृतिकरण भनिन्छ। एकपटक स्ट्र्यान्डहरू अलग भएपछि, प्राइमरहरूलाई एकल-स्ट्र्यान्ड टेम्प्लेटमा बाँध्न अनुमति दिन तापक्रम घटाइन्छ। DNA पोलिमेरेजले न्यूक्लियोटाइड चेनको स्ट्रेचमा बाँधिएर DNA प्रतिकृति सुरु गर्छ। इन्जाइम DNA पोलिमरेजले टेम्प्लेट स्ट्र्यान्डलाई प्राइमरको रूपमा प्राइमर वा प्रतिलिपि गर्न उदाहरणको रूपमा प्रयोग गर्दछ। पहिलो चक्रको नतिजाको रूपमा, हामीले निश्चित DNA खण्डको धेरै अनुक्रमिक दोब्बर प्राप्त गर्छौं। अर्को हामी यो प्रक्रिया दोहोर्याउनुहोस्। प्रत्येक चक्र पछि हामी दोब्बर मात्रामा लक्ष्य क्षेत्र प्राप्त गर्छौं। पच्चीस PCR चक्र पछि (अर्थात, दुई घण्टा भन्दा कममा), हामीसँग हाम्रो रुचिको DNA क्षेत्र मूल भन्दा 225 गुणा बढी हुन्छ (अर्थात, हामीले यसलाई लगभग 34 मिलियन पटक बढाइसकेका छौं)। वास्तवमा, इनपुटमा हामीले प्राइमरहरू, टेम्प्लेट DNA, DNA पोलिमरेज इन्जाइम र फ्री बेसहरू A, C, G र T को मिश्रण प्राप्त गर्यौं, एक विशिष्ट प्रतिक्रिया उत्पादनको मात्रा (प्राइमरहरू द्वारा सीमित) द्रुत रूपमा बढ्छ, र संख्या। "लामो" डीएनए प्रतिलिपिहरू रैखिक हुन्छन्, त्यसैले प्रतिक्रिया उत्पादनहरूमा हावी हुन्छ।

वांछित डीएनए खण्डको प्रवर्धन: पोलिमरेज चेन प्रतिक्रिया

PCR को प्रारम्भिक दिनहरूमा, मुख्य समस्या निम्न थियो: प्रत्येक तताउने-कूलिंग चक्र पछि, DNA पोलिमरेज प्रतिक्रिया मिश्रणमा थप्नुपर्थ्यो, किनकि यो 95 डिग्री सेल्सियसको तापक्रममा निष्क्रिय थियो। त्यसकारण, प्रत्येक 25 चक्र अघि यसलाई पुन: थप्न आवश्यक थियो। प्रतिक्रिया प्रक्रिया अपेक्षाकृत अक्षम थियो, धेरै समय र पोलिमरेज इन्जाइम आवश्यक थियो, र सामग्री धेरै महँगो थियो। सौभाग्यवश, आमा प्रकृति उद्धारमा आयो। धेरै जनावरहरूले 37 डिग्री सेल्सियस भन्दा धेरै तापक्रममा सहज महसुस गर्छन्। 37 डिग्री सेल्सियस अंक हाम्रो लागि किन महत्त्वपूर्ण भयो? यो भयो किनभने यो तापक्रम E. coli को लागि इष्टतम छ, जसबाट PCR को लागि पोलिमरेज इन्जाइम मूल रूपमा प्राप्त गरिएको थियो। प्रकृतिमा त्यहाँ सूक्ष्मजीवहरू छन् जसका प्रोटीनहरू, प्राकृतिक चयनको लाखौं वर्षहरू, उच्च तापमानमा बढी प्रतिरोधी भएका छन्। थर्मोफिलिक ब्याक्टेरियाबाट डीएनए पोलिमरेज प्रयोग गर्न प्रस्ताव गरिएको छ। यी इन्जाइमहरू थर्मोस्टेबल भए र धेरै प्रतिक्रिया चक्रहरू सामना गर्न सक्षम थिए। तिनीहरूको प्रयोगले पीसीआरलाई सरल र स्वचालित बनाउन सम्भव बनायो। पहिलो थर्मोस्टेबल डीएनए पोलिमरेजहरू मध्ये एउटा ब्याक्टेरियम थर्मस एक्वाटिकसबाट अलग गरिएको थियो, जुन येलोस्टोन राष्ट्रिय निकुञ्जको तातो मुहानहरूमा बस्छ, र यसलाई टाक पोलिमरेज नाम दिइएको थियो।

PCR चाँडै मानव जीनोम परियोजना को कार्यहार्स भयो। सामान्यतया, प्रक्रिया Mullis द्वारा विकसित एक भन्दा फरक छैन, यो भर्खर स्वचालित गरिएको छ। हामी अब अन्धो स्नातक विद्यार्थीहरूको भीडमा निर्भर थिएनौं जसले मेहनतका साथ प्लास्टिकको टेस्ट ट्युबमा तरलको थोपा खन्याए। आणविक आनुवंशिक अनुसन्धान गर्ने आधुनिक प्रयोगशालाहरूमा, यो काम रोबोट कन्वेयरहरूमा गरिन्छ। मानव जीनोम जत्तिकै ठूलो अनुक्रमण परियोजनामा ​​संलग्न PCR रोबोटहरू तातो-स्थिर पोलिमरेजको ठूलो मात्रामा अथक रूपमा काम गर्छन्। ह्युमन जीनोम प्रोजेक्टमा काम गरिरहेका केही वैज्ञानिकहरू युरोपेली औद्योगिक फार्मास्युटिकल विशाल होफम्यान-लारोचेको पीसीआर प्याटेन्टको मालिकले उपभोग्य वस्तुहरूको मूल्यमा थपिएको अनुचित उच्च रोयल्टीबाट आक्रोशित भएका थिए।

अर्को "ड्राइभिङ सिद्धान्त" DNA अनुक्रम विधि आफैमा थियो। यस विधिको रासायनिक आधार त्यस समयमा नयाँ थिएन: अन्तरराज्यीय मानव जीनोम परियोजना (HGP) ले 1970 को मध्यमा फ्रेड सेङ्गरले विकसित गरेको उही सरल विधि अपनायो। नवीनता स्वचालनको स्केल र डिग्रीमा राखिएको थियो जुन अनुक्रम प्राप्त गर्न सक्षम थियो।

स्वचालित अनुक्रमण मूलतः क्यालिफोर्निया इन्स्टिच्युट अफ टेक्नोलोजीमा ली हुडको प्रयोगशालामा विकसित गरिएको थियो। उनले मोन्टानाको हाई स्कूलमा भाग लिए र क्वार्टरब्याकको रूपमा कलेज फुटबल खेले; हुडलाई धन्यवाद, टोलीले राज्य च्याम्पियनशिप एक पटक भन्दा बढी जित्यो। उनको वैज्ञानिक करियरमा उनको टोली कार्य कौशल पनि काममा आयो। हुडको प्रयोगशालामा रसायनशास्त्री, जीवविज्ञानी र इन्जिनियरहरूको मोटली टोलीले काम गरेको थियो, र उनको प्रयोगशाला चाँडै प्राविधिक आविष्कारमा अग्रणी बन्यो।

वास्तवमा, स्वचालित अनुक्रम विधि लोयड स्मिथ र माइक हन्कापिलर द्वारा आविष्कार गरिएको थियो। माइक हन्कापिलर, त्यसपछि हुडको प्रयोगशालामा काम गर्दै, लोयड स्मिथलाई सुधारिएको अनुक्रमण विधिको प्रस्तावको साथ सम्पर्क गरे जसमा प्रत्येक प्रकारको आधारलाई फरक-फरक रंग दिइनेछ। यस्तो विचारले सेङ्गर प्रक्रियाको दक्षतालाई चौगुना गर्न सक्छ। Sanger मा, DNA पोलिमरेजको सहभागितामा प्रत्येक चारवटा ट्यूबहरूमा अनुक्रमण गर्दा, प्राइमर अनुक्रम सहित विभिन्न लम्बाइका ओलिगोन्यूक्लियोटाइडहरूको एक अद्वितीय सेट बनाइन्छ। त्यसपछि, फोरमाइडलाई ट्याबमा चेन सेपरेसनको लागि थपियो र चार लेनहरूमा पोलीएक्रिलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस गरिएको थियो। स्मिथ र हन्कापिलरको संस्करणमा, डिडियोक्सिन्युक्लियोटाइडलाई चार फरक रङले लेबल गरिएको छ र पीसीआर एउटै ट्यूबमा गरिन्छ। त्यसपछि, polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस को समयमा, जेल मा एक विशेष स्थान मा एक लेजर बीम रंजन को गतिविधि उत्तेजित गर्दछ, र डिटेक्टरले जेल मार्फत हाल कुन न्यूक्लियोटाइड माइग्रेट छ निर्धारण गर्दछ। सुरुमा, स्मिथ निराशावादी थिए - उसलाई डर थियो कि डाईको अल्ट्रा-लो डोज प्रयोग गर्दा न्यूक्लियोटाइड क्षेत्रहरू अविभाज्य हुन जान्छ। यद्यपि, लेजर टेक्नोलोजीको उत्कृष्ट ज्ञान भएकोले, उनले चाँडै लेजर विकिरणको सम्पर्कमा आउँदा फ्लोरोस हुने विशेष फ्लोरोक्रोम रंगहरू प्रयोग गरेर स्थितिबाट बाहिर निस्कने बाटो फेला पारे।

(पूर्ण संस्करण क्लिक गरेर - 4,08 MB) फाइन प्रिन्ट: DNA अनुक्रम एक स्वचालित अनुक्रमक प्रयोग गरेर, एक स्वचालित अनुक्रमण मेसिनबाट प्राप्त। प्रत्येक रङ चार आधारहरू मध्ये एकसँग मेल खान्छ

Sanger विधिको क्लासिक संस्करणमा, विश्लेषण गरिएको DNA को एक स्ट्र्यान्डले एन्जाइम DNA पोलिमरेजद्वारा पूरक स्ट्र्यान्डको संश्लेषणको लागि टेम्प्लेटको रूपमा कार्य गर्दछ, त्यसपछि DNA टुक्राहरूको अनुक्रमलाई आकारद्वारा जेलमा क्रमबद्ध गरिन्छ। प्रत्येक टुक्रा, जुन संश्लेषणको क्रममा DNA मा समावेश हुन्छ र प्रतिक्रिया उत्पादनहरूको पछिल्ला दृश्यलाई अनुमति दिन्छ, टर्मिनल आधारसँग सम्बन्धित फ्लोरोसेन्ट डाईको साथ लेबल गरिएको छ (यसलाई p. 124 मा छलफल गरिएको थियो); त्यसकारण, यस टुक्राको प्रतिदीप्तता दिइएको आधारको लागि पहिचानकर्ता हुनेछ। त्यसपछि सबै बाँकी छ पत्ता लगाउन र प्रतिक्रिया उत्पादनहरू कल्पना गर्न। नतिजाहरू कम्प्युटरद्वारा विश्लेषण गरिन्छ र चार न्यूक्लियोटाइडहरूसँग सम्बन्धित बहु-रंग चुचुराहरूको अनुक्रमको रूपमा प्रस्तुत गरिन्छ। त्यसपछि जानकारी सिधै कम्प्युटरको सूचना प्रणालीमा हस्तान्तरण गरिन्छ, समय-खपत र कहिलेकाहीँ पीडादायी डेटा प्रविष्टि प्रक्रियालाई हटाएर जसले अनुक्रमणलाई धेरै गाह्रो बनायो।

» पुस्तकको बारेमा थप विवरणहरू यहाँ पाउन सकिन्छ प्रकाशकको ​​वेबसाइट
» सामग्रीको तालिका
» अंश

Khabrozhiteley को लागि कुपन प्रयोग गरेर 25% छुट - PCR

स्रोत: www.habr.com