In Californiƫ is op 74-jarige leeftijd de Amerikaanse Nobelprijswinnaar in de chemie Kary Mullis overleden. Volgens zijn vrouw vond het overlijden plaats op 7 augustus. De oorzaak was hart- en ademhalingsfalen door longontsteking.
Over de bijdrage die hij aan de biochemie heeft geleverd en waarvoor hij de Nobelprijs heeft ontvangen, zal James Watson - de ontdekker van het DNA-molecuul - ons vertellen.
Fragment uit het boek van James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Geschiedenis van de genetische revolutie
Hoofdstuk 7. Het menselijk genoom. Levensscenario
ā¦
De polymerase kettingreactie (PCR) werd in 1983 uitgevonden door biochemicus Kary Mullis, die werkte voor Cetus. De ontdekking van dezereactie was bijzonder opmerkelijk. Later herinnerde Mullis zich:\u201cEens op een vrijdavond in april 1983 werd ik plotseling geraakt door een idee. Ik was aan het rijden op een met maanlicht bezaaide kronkelige bergweg in Noord-CaliforniĆ«, het land van de sequoia-bossen\u201d. Het is indrukwekkend dat hij juist in zo'n situatie geĆÆnspireerd raakte. Het heeft er niets mee te maken dat de wegen in Noord-CaliforniĆ« bijzonder zijn en creatieve ingevingen bevorderen; het was gewoon dat een vriend ooit had gezien hoe Mullis roekeloos over een ijzige weg met twee richtingen reed, en dat hem totaal niet stoorde. De vriend vertelde de New York Times: \u201cMullis had het idee dat hij zou sterven door tegen een sequoia te rijden. Daarom is hij niet bang om te rijden, zolang er geen sequoia's langs de weg staan\u201d. De aanwezigheid van sequoia's langs de weg dwong Mullis om zich te concentreren enā¦ daar was het, de inspiratie. Voor zijn uitvinding ontving Mullis in 1993 de Nobelprijs voor de chemie en vanaf dat moment gedroeg hij zich nog vreemder. Zo is hij een voorvechter van een revisionistische theorie dat AIDS niet gerelateerd is aan HIV, wat zijn reputatie behoorlijk heeft beschadigd en artsen heeft verhinderd.
PCR is een vrij eenvoudige reactie. Voor de uitvoering hebben we twee chemisch gesynthetiseerde primers nodig, complementair aan de tegenovergestelde uiteinden van verschillende strengen van het vereiste DNA-fragment. Primers zijn korte segmenten van enkelstrengs DNA, elk ongeveer 20 basenparen lang. De bijzondere eigenschap van de primers is dat ze overeenkomen met de segmenten van het DNA die geamplificeerd moeten worden, dat wil zeggen het DNA-matrix.
(Afbeelding is klikbaar) Kary Mullis, uitvinder van de PCR
De specificiteit van PCR is gebaseerd op de vorming van complementaire complexen tussen de matrix en primers, korte synthetische oligonucleotiden. Elke primer is complementair aan een van de strengen van de tweevoudige matrix en markeert het begin en het einde van het te amplificeren segment. De verkregen "matrix" is feitelijk een volledige genoom, en ons doel is het isoleren van de interessante fragmenten. Hiervoor wordt de dubbele DNA-matrix enkele minuten verwarmd tot 95 Ā°C, zodat de DNA-strengen zich van elkaar scheiden. Deze fase wordt denaturatie genoemd, omdat de waterstofbindingen tussen de twee DNA-strengen worden verbroken. Wanneer de strengen zijn gescheiden, wordt de temperatuur verlaagd zodat de primers zich kunnen binden aan de enkele matrix. DNA-polymerase begint met de replicatie van DNA door zich te binden aan een segment van de nucleotideketen. Het enzym DNA-polymerase reproduceert de matrijsstreng door de primer als een startpunt te gebruiken voor het kopiĆ«ren. Het resultaat van de eerste cyclus is een meervoudige opeenvolgende verdubbeling van een specifiek segment DNA. Vervolgens herhalen we deze procedure. Na elke cyclus krijgen we het doelwitsegment in dubbele hoeveelheid. Na vijfentwintig PCR-cycli (dus binnen minder dan twee uur) hebben we het interessante segment DNA in een hoeveelheid die 225 keer de oorspronkelijke hoeveelheid overschrijdt (dat wil zeggen, we hebben het zo ongeveer 34 miljoen keer geamplificeerd). Feitelijk kregen we bij de ingang een mengsel van primers, matrix-DNA, het enzym DNA-polymerase en vrije basen A, C, G en T, waarbij de hoeveelheid van het specifieke product van de reactie (afgebakend door de primers) exponentieel toeneemt, en de hoeveelheid "lange" DNA-kopieĆ«n lineair, waardoor het specifieke product in de reactie domineert.
Amplificatie van het gewenste segment DNA: polymerase kettingreactie
Aan het begin van het gebruik van PCR was het belangrijkste probleem als volgt: na elke verwarmings- en koelcyclus moest er DNA-polymerase aan het reactiemengsel worden toegevoegd, omdat het inactief werd bij 95 Ā°C. Daarom moest het opnieuw worden toegevoegd voor elke van de 25 cycli. De procedure voor het uitvoeren van de reactie was relatief inefficiĆ«nt, vergde veel tijd en het enzym polymerase was vrij kostbaar. Gelukkig kwam de natuur ons te hulp. Veel dieren voelen zich comfortabel bij temperaturen die veel hoger zijn dan 37 Ā°C. Waarom is de temperatuur van 37 Ā°C belangrijk voor ons geworden? Dit kwam omdat deze temperatuur optimaal is voor E. coli, waaruit oorspronkelijk het polymerase-enzym voor PCR werd gewonnen. In de natuur zijn er micro-organismen wiens eiwitten door miljoenen jaren van natuurlijke selectie bestand zijn geworden tegen hoge temperaturen. Het is voorgesteld om DNA-polymerases uit thermofiele bacteriĆ«n te gebruiken. Deze enzymen bleken thermostabiel te zijn en waren in staat om vele reactiecylussen te doorstaan. Het gebruik ervan maakte het uitvoeren en automatiseren van PCR eenvoudiger. Een van de eerste thermostabiele DNA-polymerases werd geĆÆsoleerd uit de bacterie Thermus aquaticus, die leeft in de warme bronnen van het Yellowstone National Park, en werd Taq-polymerase genoemd.
PCR is snel uitgegroeid tot het belangrijkste werkpaard van het Human Genome Project. Over het algemeen verschilt het proces niet van datgene dat door Mullis is ontwikkeld, het is gewoon geautomatiseerd. We waren niet langer afhankelijk van een groep halfblinde promovendi die zorgvuldig druppels vloeistof in plastic buisjes overbrachten. In moderne laboratoria die moleculair-genetisch onderzoek doen, wordt dit werk uitgevoerd op geautomatiseerde assemblagelijnen. PCR-robots die werken aan een grootschalig sequenceringsproject zoals het Human Genome Project, werken onvermoeibaar met enorme hoeveelheden hittebestendige polymerase. Sommige wetenschappers die aan het Human Genome Project werkten, waren verontwaardigd over de onterecht hoge afdracht die de patenthouder van PCR, de Europese industrie-farma gigant Hoffmann-LaRoche, aan de kosten van verbruiksartikelen toevoegt.
Een andere "drijvende kracht" was de methode van DNA-sequencing zelf. De chemische basis van deze methode was op dat moment geen noviteit meer: het tussenstaatlijke project "Menselijk Genoom" (HGP) had dezelfde ingenieuze methode overgenomen die Fred Sanger in het midden van de jaren '70 had ontwikkeld. De innovaties lagen echter in de schaal en de mate van automatisering die bereikt was bij sequencing.
Automatische sequencing werd oorspronkelijk ontwikkeld in het laboratorium van Lee Hood aan het California Institute of Technology. Hij rondde zijn middelbare school af in de staat Montana en speelde American football als aanvaller; dankzij Hood won het team meerdere keren het staatskampioenschap. De vaardigheden in teamwerk kwamen ook goed van pas in zijn wetenschappelijke carriĆØre. In Hood's laboratorium werkte een diverse groep chemici, biologen en ingenieurs, en al snel werd zijn laboratorium een leider in technologische innovaties.
In feite werd de methode voor automatische sequencing uitgevonden door Lloyd Smith en Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, die destijds bij het Hudalaboratorium werkte, wendde zich tot Lloyd Smith met het voorstel voor een geavanceerde sequencingmethode, waarbij de basen van elk type in een andere kleur zouden worden gekleurd. Dit idee zou de efficiĆ«ntie van het Sanger-proces vier keer kunnen verhogen. Bij Sanger ontstaat bij het sequencen in elk van de vier buizen (een voor elke base) met behulp van DNA-polymerase een unieke set oligonucleotiden van verschillende lengtes, inclusief de primersequentie. Vervolgens werd er formamide aan de buizen toegevoegd om de ketens te scheiden en werd er elektrophorese uitgevoerd in een polyacrylamidegel met vier sporen. In de variant van Smith en Hunkapiller worden dideoxynucleotiden gemarkeerd met vier verschillende kleurstoffen en wordt PCR in Ć©Ć©n buis uitgevoerd. Tijdens de elektrophorese in de polyacrylamidegel activeert een laserstraal op een bepaalde plaats in de gel de activiteit van de kleurstoffen, en de detector bepaalt welke nucleotid momenteel door de gel migreert. Aanvankelijk was Smith pessimistisch ā hij vreesde dat het gebruik van extreem kleine hoeveelheden kleurstof zou leiden tot ondetecteerbare nucleotidefragmenten. Echter, als expert in lasertechnologieĆ«n vond hij al snel een oplossing door speciale fluorochrome kleurstoffen te gebruiken die fluoresceren onder invloed van laserstraling.
(Volledige versie ā 4,08 MB) Kleine lettertype: de DNA-sequentie die is ontcijferd met een automatische sequencer, verkregen van de apparatuur voor automatische sequencing. Elke kleur komt overeen met een van de vier basen
In de klassieke variant van de Sanger-methode fungeert een van de ketens van de te analyseren DNA als matrix voor de synthese van een complementaire keten door het enzym DNA-polymerase. Vervolgens worden de sequenties van DNA-fragmenten op grootte gesorteerd in een gel. Elk fragment dat wordt opgenomen in de DNA-synthese en dat later de visualisatie van de products van de reactie mogelijk maakt, wordt gemarkeerd met een fluorescerende kleurstof die overeenkomt met de terminale base (dit werd besproken op blz. 124); derhalve zal de fluorescentie van dit fragment de identificatie zijn voor de betreffende base. Daarna blijft het enkel om de detectie uit te voeren en de products van de reactie te visualiseren. De resultaten worden geanalyseerd met behulp van een computer en gepresenteerd in de vorm van een sequentie van gekleurde pieken die overeenkomen met de vier nucleotiden. Vervolgens wordt de informatie rechtstreeks naar het informatiesysteem van de computer gezonden, waardoor het tijdrovende en soms pijnlijke proces van gegevensinvoer, dat het sequencen aanzienlijk bemoeilijkte, wordt geƫlimineerd.
Ā» Meer informatie over het boek is te vinden op
Ā»
Ā»
Voor Habr-bewoners is er 25% korting met de coupon ā PCR
Bron: habr.com
