De Amerikaanse Nobelprijswinnaar voor scheikunde Kary Mullis stierf op 74-jarige leeftijd in Californië. Volgens zijn vrouw vond de dood plaats op 7 augustus. De oorzaak is hart- en ademhalingsfalen als gevolg van longontsteking.
James Watson zelf, de ontdekker van het DNA-molecuul, zal vertellen over zijn bijdrage aan de biochemie en waarvoor hij de Nobelprijs ontving.
Fragment uit het boek van James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Geschiedenis van de genetische revolutie
Hoofdstuk 7. Menselijk genoom. Levensscenario
...
De polymerasekettingreactie (PCR) werd in 1983 uitgevonden door biochemicus Carey Mullis, die bij Cetus werkte. De ontdekking van deze reactie was behoorlijk opmerkelijk. Mullis herinnerde zich later: ‘Op een vrijdagavond in april 1983 kreeg ik een openbaring. Ik zat achter het stuur en reed over een maanverlichte, kronkelige bergweg in Noord-Californië, het land van de sequoiabossen. Het is indrukwekkend dat juist in zo’n situatie de inspiratie tot hem doordrong. En het is niet zo dat Noord-Californië speciale wegen heeft die inzicht bevorderen; het is alleen dat zijn vriend Mullis ooit roekeloos over een ijskoude vierbaansweg zag rijden en dat hij er helemaal geen last van had. Een vriend vertelde de New York Times: “Mullis had een visioen dat hij zou sterven door tegen een sequoiaboom te botsen. Daarom is hij nergens bang voor tijdens het rijden, tenzij er sequoia’s langs de weg groeien.” De aanwezigheid van sequoia's langs de weg dwong Mullis zich te concentreren en... hier was het, een inzicht. Mullis ontving in 1993 de Nobelprijs voor de Scheikunde voor zijn uitvinding en is sindsdien nog vreemder geworden in zijn daden. Hij is bijvoorbeeld een voorstander van de revisionistische theorie dat AIDS geen verband houdt met HIV, wat zijn eigen reputatie aanzienlijk ondermijnde en artsen hinderde.
PCR is een vrij eenvoudige reactie. Om dit uit te voeren hebben we twee chemisch gesynthetiseerde primers nodig die complementair zijn aan de tegenovergestelde uiteinden van verschillende strengen van het vereiste DNA-fragment. Primers zijn korte stukjes enkelstrengs DNA, elk ongeveer 20 basenparen lang. De eigenaardigheid van primers is dat ze overeenkomen met de DNA-secties die moeten worden geamplificeerd, dat wil zeggen de DNA-sjabloon.
(Afbeelding klikbaar) Kary Mullis, uitvinder van PCR
De specificiteit van PCR is gebaseerd op de vorming van complementaire complexen tussen de matrijs en primers, korte synthetische oligonucleotiden. Elke primer is complementair aan één van de strengen van de dubbelstrengige matrijs en beperkt het begin en het einde van het geamplificeerde gebied. In feite is de resulterende ‘matrix’ een heel genoom, en ons doel is om de fragmenten die voor ons van belang zijn daaruit te isoleren. Om dit te doen, wordt de dubbelstrengige DNA-sjabloon gedurende enkele minuten verwarmd tot 95 ° C om de DNA-strengen te scheiden. Deze fase wordt denaturatie genoemd omdat de waterstofbruggen tussen de twee DNA-strengen worden verbroken. Zodra de strengen zijn gescheiden, wordt de temperatuur verlaagd zodat de primers aan de enkelstrengige matrijs kunnen binden. DNA-polymerase begint DNA-replicatie door te binden aan een stuk nucleotideketen. Het enzym DNA-polymerase repliceert de matrijsstreng met behulp van een primer als primer of voorbeeld voor kopiëren. Als resultaat van de eerste cyclus verkrijgen we meerdere opeenvolgende verdubbelingen van een bepaald DNA-fragment. Vervolgens herhalen we deze procedure. Na elke cyclus verkrijgen we een doelgebied in dubbele hoeveelheid. Na vijfentwintig PCR-cycli (dat wil zeggen in minder dan twee uur) hebben we het voor ons interessante DNA-gebied in een hoeveelheid die 225 keer hoger is dan het origineel (dat wil zeggen, we hebben het ongeveer 34 miljoen keer geamplificeerd). In feite kregen we bij de invoer een mengsel van primers, template-DNA, het DNA-polymerase-enzym en de vrije basen A, C, G en T, de hoeveelheid van een specifiek reactieproduct (beperkt door de primers) groeit exponentieel, en het aantal van “lange” DNA-kopieën is lineair, dus in reactieproducten domineert.
Amplificatie van de gewenste DNA-sectie: polymerasekettingreactie
In de begindagen van PCR was het grootste probleem het volgende: na elke verwarmings-koelcyclus moest DNA-polymerase aan het reactiemengsel worden toegevoegd, omdat het werd geïnactiveerd bij een temperatuur van 95 ° C. Daarom was het nodig om het vóór elk van de 25 cycli opnieuw toe te voegen. De reactieprocedure was relatief inefficiënt, vergde veel tijd en het polymerase-enzym, en het materiaal was erg duur. Gelukkig kwam Moeder Natuur te hulp. Veel dieren voelen zich prettig bij temperaturen veel hoger dan 37 °C. Waarom is het getal 37 °C voor ons belangrijk geworden? Dit gebeurde omdat deze temperatuur optimaal is voor E. coli, waaruit oorspronkelijk het polymerase-enzym voor PCR werd verkregen. In de natuur zijn er micro-organismen waarvan de eiwitten, gedurende miljoenen jaren van natuurlijke selectie, beter bestand zijn geworden tegen hoge temperaturen. Er is voorgesteld om DNA-polymerasen van thermofiele bacteriën te gebruiken. Deze enzymen bleken thermostabiel en konden vele reactiecycli doorstaan. Het gebruik ervan maakte het mogelijk om PCR te vereenvoudigen en te automatiseren. Een van de eerste thermostabiele DNA-polymerasen werd geïsoleerd uit de bacterie Thermus Aquaticus, die leeft in de warmwaterbronnen van het Yellowstone National Park, en werd Taq-polymerase genoemd.
PCR werd al snel het werkpaard van het Human Genome Project. Over het algemeen verschilt het proces niet van het proces dat Mullis heeft ontwikkeld, het is alleen geautomatiseerd. We waren niet langer afhankelijk van een menigte domme afgestudeerde studenten die nauwgezet druppeltjes vloeistof in plastic reageerbuisjes goten. In moderne laboratoria die moleculair genetisch onderzoek uitvoeren, wordt dit werk uitgevoerd op robotachtige transportbanden. PCR-robots die betrokken zijn bij een sequencingproject zo groot als het menselijk genoom, werken meedogenloos met enorme hoeveelheden hittestabiele polymerase. Sommige wetenschappers die aan het Human Genome Project werkten, waren verontwaardigd over de onredelijk hoge royalty's die de eigenaar van het PCR-patent, de Europese industriële farmaceutische gigant Hoffmann-LaRoche, aan de kosten van verbruiksartikelen had toegevoegd.
Een ander ‘drijvend principe’ was de DNA-sequencing-methode zelf. De chemische basis van deze methode was destijds niet meer nieuw: het Interstate Human Genome Project (HGP) adopteerde dezelfde ingenieuze methode die Fred Sanger halverwege de jaren zeventig had ontwikkeld. De innovatie lag in de schaal en mate van automatisering die sequencing kon bereiken.
Geautomatiseerde sequencing werd oorspronkelijk ontwikkeld in het laboratorium van Lee Hood aan het California Institute of Technology. Hij ging naar de middelbare school in Montana en speelde universiteitsvoetbal als quarterback; Dankzij Hood won het team meer dan eens het staatskampioenschap. Zijn teamwerkvaardigheden kwamen ook goed van pas in zijn wetenschappelijke carrière. Hoods laboratorium werd bemand door een bont gezelschap van scheikundigen, biologen en ingenieurs, en zijn laboratorium werd al snel een leider op het gebied van technologische innovatie.
In feite is de geautomatiseerde sequencing-methode uitgevonden door Lloyd Smith en Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, die toen in het laboratorium van Hood werkte, benaderde Lloyd Smith met een voorstel voor een verbeterde sequentiemethode waarbij elk type basis anders gekleurd zou zijn. Een dergelijk idee zou de efficiëntie van het Sanger-proces kunnen verviervoudigen. In Sanger wordt bij het sequencen in elk van de vier buizen (op basis van het aantal basen), met de deelname van DNA-polymerase, een unieke set oligonucleotiden van verschillende lengtes gevormd, inclusief een primersequentie. Vervolgens werd formamide aan de buizen toegevoegd voor ketenscheiding en werd polyacrylamidegelelektroforese uitgevoerd op vier rijstroken. In de versie van Smith en Hunkapiller worden dideoxynucleotiden gelabeld met vier verschillende kleurstoffen en wordt PCR in één buis uitgevoerd. Vervolgens stimuleert een laserstraal op een specifieke locatie op de gel tijdens polyacrylamidegelelektroforese de activiteit van de kleurstoffen, en bepaalt de detector welk nucleotide momenteel door de gel migreert. Aanvankelijk was Smith pessimistisch: hij vreesde dat het gebruik van ultralage doses kleurstof ertoe zou leiden dat de nucleotidegebieden niet meer van elkaar te onderscheiden zouden zijn. Omdat hij echter een uitstekend begrip had van de lasertechnologie, vond hij al snel een uitweg uit de situatie door speciale fluorochroomkleurstoffen te gebruiken die fluoresceren bij blootstelling aan laserstraling.
(Volledige versie - 4,08 MB) Kleine lettertjes: DNA-sequentie bepaald met behulp van een automatische sequencer, verkregen van een automatische sequencing-machine. Elke kleur komt overeen met een van de vier basissen
In de klassieke versie van de Sanger-methode fungeert een van de strengen van het geanalyseerde DNA als sjabloon voor de synthese van een complementaire streng door het enzym DNA-polymerase, waarna de volgorde van de DNA-fragmenten in een gel op grootte wordt gesorteerd. Elk fragment, dat tijdens de synthese in het DNA wordt opgenomen en daaropvolgende visualisatie van reactieproducten mogelijk maakt, wordt gelabeld met een fluorescerende kleurstof die overeenkomt met de terminale base (dit werd besproken op p. 124); daarom zal de fluorescentie van dit fragment een identificatie zijn voor een gegeven base. Dan rest alleen nog het detecteren en visualiseren van de reactieproducten. De resultaten worden door een computer geanalyseerd en weergegeven als een reeks veelkleurige pieken die overeenkomen met vier nucleotiden. De informatie wordt vervolgens rechtstreeks naar het informatiesysteem van de computer overgebracht, waardoor het tijdrovende en soms pijnlijke gegevensinvoerproces wordt geëlimineerd dat het opeenvolgen van gegevens erg moeilijk maakte.
» Meer details over het boek zijn te vinden op
»
»
Voor Khabrozhiteley 25% korting met coupon - PCR
Bron: www.habr.com