Den amerikanske nobelprisvinneren i kjemi Kary Mullis døde i California i en alder av 74. Ifølge kona inntraff dødsfallet 7. august. Årsaken er hjerte- og respirasjonssvikt på grunn av lungebetennelse.
James Watson selv, oppdageren av DNA-molekylet, vil fortelle oss om sitt bidrag til biokjemi og som han mottok Nobelprisen for.
Utdrag fra boken av James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Historien om den genetiske revolusjonen
Kapittel 7. Menneskets genom. Livsscenario
...
Polymerasekjedereaksjonen (PCR) ble oppfunnet i 1983 av biokjemikeren Carey Mullis, som jobbet ved Cetus. Oppdagelsen av denne reaksjonen var ganske bemerkelsesverdig. Mullis husket senere: «En fredagskveld i april 1983 hadde jeg en åpenbaring. Jeg satt bak rattet og kjørte ned en månebelyst, svingete fjellvei i Nord-California, redwood-skogenes land.» Det er imponerende at det var i en slik situasjon inspirasjonen slo ham. Og det er ikke det at Nord-California har spesielle veier som fremmer innsikt; det er bare det at vennen hans en gang så Mullis ruse hensynsløst langs en isete to kjørebane, og det plaget ham ikke i det hele tatt. En venn fortalte New York Times: «Mullis hadde en visjon om at han ville dø ved å krasje inn i et redwood-tre. Derfor er han ikke redd for noe mens han kjører, med mindre det vokser redwoodtrær langs veien.» Tilstedeværelsen av redwoods langs veien tvang Mullis til å konsentrere seg og... her var det et innblikk. Mullis mottok Nobelprisen i kjemi for sin oppfinnelse i 1993 og har siden blitt enda merkeligere i sine handlinger. For eksempel er han tilhenger av den revisjonistiske teorien om at AIDS ikke er relatert til HIV, noe som i betydelig grad undergravde hans eget rykte og forstyrret leger.
PCR er en ganske enkel reaksjon. For å utføre det trenger vi to kjemisk syntetiserte primere som er komplementære til de motsatte endene av forskjellige tråder av det nødvendige DNA-fragmentet. Primere er korte deler av enkelttrådet DNA, hver omtrent 20 basepar lange. Det særegne med primere er at de tilsvarer DNA-seksjonene som må amplifiseres, det vil si DNA-malen.
(Klikkbart bilde) Kary Mullis, oppfinner av PCR
Spesifisiteten til PCR er basert på dannelsen av komplementære komplekser mellom malen og primere, korte syntetiske oligonukleotider. Hver primer er komplementær til en av trådene til den dobbelttrådete malen og begrenser begynnelsen og slutten av den amplifiserte regionen. Faktisk er den resulterende "matrisen" et helt genom, og målet vårt er å isolere fragmentene av interesse for oss fra den. For å gjøre dette oppvarmes den dobbelttrådete DNA-malen til 95 °C i flere minutter for å skille DNA-trådene. Dette stadiet kalles denaturering fordi hydrogenbindingene mellom de to DNA-trådene brytes. Når strengene har skilt seg, senkes temperaturen for å la primerne binde seg til den enkelttrådede malen. DNA-polymerase begynner DNA-replikasjon ved å binde seg til en strekning av nukleotidkjeden. Enzymet DNA-polymerase replikerer malstrengen ved å bruke en primer som primer eller eksempel for kopiering. Som et resultat av den første syklusen oppnår vi flere sekvensielle doblinger av en viss DNA-seksjon. Deretter gjentar vi denne prosedyren. Etter hver syklus får vi et målområde i dobbel mengde. Etter tjuefem PCR-sykluser (det vil si på mindre enn to timer), har vi DNA-området av interesse for oss i en mengde 225 ganger høyere enn originalen (det vil si at vi har amplifisert den omtrent 34 millioner ganger). Faktisk, ved inngangen mottok vi en blanding av primere, mal-DNA, DNA-polymerase-enzymet og frie baser A, C, G og T, mengden av et spesifikt reaksjonsprodukt (begrenset av primerne) vokser eksponentielt, og antallet av "lange" DNA-kopier er lineær, så i reaksjonen dominerer produktene.
Amplifikasjon av ønsket DNA-seksjon: polymerasekjedereaksjon
I de første dagene av PCR var hovedproblemet følgende: etter hver oppvarming-avkjølingssyklus måtte DNA-polymerase tilsettes reaksjonsblandingen, siden den ble inaktivert ved en temperatur på 95 ° C. Derfor var det nødvendig å legge den til på nytt før hver av de 25 syklusene. Reaksjonsprosedyren var relativt ineffektiv, krevde mye tid og polymeraseenzymet, og materialet var svært kostbart. Heldigvis kom Moder Natur til unnsetning. Mange dyr føler seg komfortable ved temperaturer mye høyere enn 37 °C. Hvorfor ble tallet 37 °C viktig for oss? Dette skjedde fordi denne temperaturen er optimal for E. coli, som polymeraseenzymet for PCR opprinnelig ble hentet fra. I naturen er det mikroorganismer hvis proteiner, over millioner av år med naturlig utvalg, har blitt mer motstandsdyktige mot høye temperaturer. Det er foreslått å bruke DNA-polymeraser fra termofile bakterier. Disse enzymene viste seg å være termostabile og var i stand til å motstå mange reaksjonssykluser. Bruken av dem gjorde det mulig å forenkle og automatisere PCR. En av de første termostabile DNA-polymerasene ble isolert fra bakterien Thermus aquaticus, som lever i de varme kildene i Yellowstone nasjonalpark, og fikk navnet Taq-polymerase.
PCR ble raskt arbeidshesten til Human Genome Project. Generelt er prosessen ikke forskjellig fra den som er utviklet av Mullis, den har nettopp blitt automatisert. Vi var ikke lenger avhengige av en mengde uklare hovedfagsstudenter som møysommelig helte dråper med væske i plastreagensrør. I moderne laboratorier som utfører molekylærgenetisk forskning, utføres dette arbeidet på robottransportører. PCR-roboter involvert i et sekvenseringsprosjekt så stort som det menneskelige genomet jobber nådeløst med enorme volumer av varmestabil polymerase. Noen forskere som jobbet med Human Genome Project ble rasende over de urimelig høye royaltyene som ble lagt til kostnadene for forbruksvarer av eieren av PCR-patentet, den europeiske industrielle farmasøytiske giganten Hoffmann-LaRoche.
Et annet "drivprinsipp" var selve DNA-sekvenseringsmetoden. Det kjemiske grunnlaget for denne metoden var ikke lenger nytt på den tiden: Interstate Human Genome Project (HGP) tok i bruk den samme geniale metoden som Fred Sanger hadde utviklet tilbake på midten av 1970-tallet. Innovasjonen lå i omfanget og graden av automatisering som sekvensering var i stand til å oppnå.
Automatisert sekvensering ble opprinnelig utviklet i Lee Hoods laboratorium ved California Institute of Technology. Han gikk på videregående skole i Montana og spilte college-fotball som quarterback; Takket være Hood vant laget delstatsmesterskapet mer enn én gang. Hans teamarbeidsevner kom også godt med i hans vitenskapelige karriere. Hoods laboratorium var bemannet av et broket mannskap av kjemikere, biologer og ingeniører, og laboratoriet hans ble snart ledende innen teknologisk innovasjon.
Faktisk ble den automatiserte sekvenseringsmetoden oppfunnet av Lloyd Smith og Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, som da jobbet i Hoods laboratorium, henvendte seg til Lloyd Smith med et forslag til en forbedret sekvenseringsmetode der hver type base ville bli farget forskjellig. En slik idé kan firedoble effektiviteten til Sanger-prosessen. I Sanger, ved sekvensering i hvert av fire rør (i henhold til antall baser), med deltakelse av DNA-polymerase, dannes et unikt sett med oligonukleotider av forskjellig lengde, inkludert en primersekvens. Deretter ble formamid tilsatt til rørene for kjedeseparasjon og polyakrylamidgelelektroforese ble utført på fire baner. I Smith og Hunkapillers versjon er dideoksynukleotider merket med fire forskjellige fargestoffer og PCR utføres i ett rør. Deretter, under polyakrylamidgelelektroforese, stimulerer en laserstråle på et bestemt sted på gelen aktiviteten til fargestoffene, og detektoren bestemmer hvilket nukleotid som for tiden migrerer gjennom gelen. Til å begynne med var Smith pessimistisk – han fryktet at bruk av ultralave doser fargestoff ville føre til at nukleotidregionene ikke kunne skilles. Men med en utmerket forståelse av laserteknologi fant han snart en vei ut av situasjonen ved å bruke spesielle fluorokromfargestoffer som fluorescerer når de ble utsatt for laserstråling.
(Fullversjon - 4,08 MB) Fin skrift: DNA-sekvens sekvensert ved hjelp av en automatisk sekvenser, hentet fra en automatisk sekvenseringsmaskin. Hver farge tilsvarer en av fire baser
I den klassiske versjonen av Sanger-metoden fungerer en av trådene til det analyserte DNA som en mal for syntesen av en komplementær tråd av enzymet DNA-polymerase, deretter sorteres sekvensen av DNA-fragmenter i en gel etter størrelse. Hvert fragment, som er inkludert i DNA under syntese og tillater påfølgende visualisering av reaksjonsprodukter, er merket med et fluorescerende fargestoff tilsvarende den terminale basen (dette ble diskutert på s. 124); derfor vil fluorescensen til dette fragmentet være en identifikator for en gitt base. Da gjenstår det bare å utføre deteksjon og visualisere reaksjonsproduktene. Resultatene analyseres med datamaskin og presenteres som en sekvens av flerfargede topper som tilsvarer fire nukleotider. Informasjonen blir deretter overført direkte til datamaskinens informasjonssystem, og eliminerer den tidkrevende og noen ganger smertefulle dataregistreringsprosessen som gjorde sekvensering svært vanskelig.
» For mer informasjon om boken, vennligst besøk
»
»
For Khabrozhiteli 25% rabatt på kupongen - PCR
Kilde: www.habr.com