W Kalifornii w wieku 74 lat zmarł amerykański laureat Nagrody Nobla w dziedzinie chemii, Cary Mullis. Jak powiedziała jego żona, śmierć nastąpiła 7 sierpnia. Powód to niewydolność serca i układu oddechowego spowodowana zapaleniem płuc.
O tym, jaki wkład wniósł w biochemię i za co otrzymał Nagrodę Nobla, opowie nam sam James Watson — odkrywca cząsteczki DNA.
Fragment książki Jamesa Watsona, Andrew Barry'ego, Kevina Davisa
DNA. Historia rewolucji genetycznej
Rozdział 7. Ludzkie genom. Scenariusz życia
…
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) została wynaleziona w 1983 roku przez biochemika Cary'ego Mullisa, który pracował w firmie Cetus. Odkrycie tej reakcji było bardzo znaczące. Mullis wspominał później: „Pewnego piątkowego wieczoru w kwietniu 1983 roku, oświeciło mnie. Jechałem, sunąc po oświetlonej blaskiem księżyca krętej górskiej drodze w północnej Kalifornii, w pobliżu lasów sekwojowych”. Imponujące, że właśnie w takiej sytuacji odwiedziła go inspiracja. I nie chodzi wcale o to, że na północy Kalifornii są szczególne drogi, które sprzyjają olśnieniu; po prostu jego przyjaciel raz widział, jak Mullis bezmyślnie pędził po oblodzonej drodze z dwoma pasami ruchu i w ogóle się tym nie przejmował. Przyjaciel powiedział New York Times: „Mullis widział w swoim umyśle, że zginie, uderzając w sekwoję. Dlatego niczego się nie boi za kierownicą, jeśli przy drodze nie rosną sekwoje”. Obecność sekwoi wzdłuż drogi zmuszała Mullisa do koncentracji i… oto, olśnienie. Za swoje wynalazki w 1993 roku Mullis otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii i od tego czasu stał się jeszcze dziwniejszy w swoich czynach. Na przykład jest zwolennikiem rewizjonistycznej teorii, że AIDS nie jest związane z HIV, co znacznie zaszkodziło jego reputacji i zaszkodziło lekarzom.
PCR to dość prosta reakcja. Do jej przeprowadzenia potrzebujemy dwóch chemiczniesyntetyzowanych starterów, komplementarnych do przeciwnych końców różnych łańcuchów żądanego fragmentu DNA. Startery to krótkie odcinki jednoniciowego DNA, każdy o długości około 20 par zasad. Cechą starterów jest to, że odpowiadają odcinkom DNA, które należy amplifikować, czyli matrycy DNA.
(Obrazek klikalny) Cary Mullis, wynalazca PCR
Specyficzność PCR opiera się na tworzeniu komplementarnych kompleksów między matrycą a primerami, krótkimi syntetycznymi oligonukleotydami. Każdy z primerów jest komplementarny do jednej z nici podwójnej matrycy i ogranicza początek i koniec amplifikowanego odcinka. Faktycznie uzyskana "matryca" stanowi integralny genom, a naszym celem jest wyizolowanie interesujących nas fragmentów. W tym celu podwójna matryca DNA jest podgrzewana do 95 °C na kilka minut, aby nici DNA się rozdzieliły. Ten etap nazywany jest denaturacją, ponieważ wiązania wodorowe między dwiema nićmi DNA ulegają zniszczeniu. Kiedy nici się rozdzielą, obniża się temperaturę, aby primery mogły połączyć się z jednoniciową matrycą. Polimeraza DNA zaczyna replikację DNA, łącząc się z odcinkiem nici nukleotydów. Enzym polimeraza DNA replikuje matrycową nić, używając primeru jako startera lub wzorca do kopiowania. W wyniku pierwszej pętli uzyskujemy wielokrotne sekwencyjne podwojenie określonego odcinka DNA. Następnie powtarzamy tę procedurę. Po każdym cyklu uzyskujemy docelowy odcinek w podwójnej ilości. Po dwudziestu pięciu cyklach PCR (czyli w mniej niż dwie godziny) mamy interesujący nas odcinek DNA w ilości, która jest 225 razy większa od początkowej (czyli amplifikowaliśmy go około 34 miliony razy). W rzeczywistości na wejściu otrzymywaliśmy mieszankę primerów, matrycowego DNA, enzymu polimerazy DNA i wolnych zasad A, C, G i T; ilość specyficznego produktu reakcji (ograniczonego primerami) rośnie wykładniczo, podczas gdy ilość "długich" kopii DNA rośnie liniowo, dlatego w produktach reakcji dominuje.
Amplifikacja potrzebnego odcinka DNA: reakcja łańcuchowa polimerazy
Na początku wykorzystania PCR głównym problemem było to, że po każdym cyklu podgrzewania i chłodzenia konieczne było dodanie do mieszaniny reakcyjnej polimerazy DNA, ponieważ ulegała inaktywacji w temperaturze 95 °C. Dlatego trzeba ją było dodawać ponownie przed każdym z 25 cykli. Procedura przeprowadzania reakcji była stosunkowo mało efektywna, wymagała dużo czasu i drogiego enzymu polimerazy. Na szczęście z pomocą przyszła matka natura. Wiele zwierząt czuje się komfortowo w temperaturach znacznie powyżej 37 °C. Dlaczego ta liczba 37 °C stała się dla nas tak istotna? Ponieważ temperatura ta jest optymalna dla E. coli, z której początkowo pozyskiwano enzym polimerazę do PCR. W naturze występują mikroorganizmy, których białka przez miliony lat naturalnej selekcji stały się bardziej odporne na działanie wysokich temperatur. Zaproponowano wykorzystanie polimeraz DNA z bakterii termofilnych. Te enzymy okazały się termostabilne i były w stanie wytrzymać wiele cykli reakcji. Ich użycie pozwoliło uprościć i zautomatyzować przeprowadzanie PCR. Jedna z pierwszych termostabilnych polimeraz DNA została wyodrębniona z bakterii Thermus aquaticus, która żyje w gorących źródłach Parku Narodowego Yellowstone i została nazwana polimerazą Taq.
PCR szybko stała się głównym koniem roboczym projektu „Ludzkiego Genomu”. W zasadzie proces nie różni się od tego opracowanego przez Mullisa, po prostu został zautomatyzowany. Nie byliśmy już zależni od tłumu niedowidzących doktorantów, skrupulatnie przelewających krople cieczy do plastikowych probówek. W nowoczesnych laboratoriach zajmujących się badaniami molekularno-genetycznymi prace te są wykonywane na zrobotyzowanych liniach produkcyjnych. Roboty PCR, zaangażowane w tak ogromny projekt sekwencjonowania jak „Ludzki genom”, nieustannie pracują z ogromnymi ilościami termostabilnej polimerazy. Niektórzy naukowcy pracujący nad projektem „Ludzkiego Genomu” byli oburzeni nieuzasadnionymi wysokimi opłatami, które dodaje do kosztów materiałów eksploatacyjnych właściciel patentu na PCR, europejski gigant przemysłowo-farmaceutyczny Hoffmann-LaRoche.
Innym „silnikiem napędowym” była sama metoda sekwencjonowania DNA. Chemiczna podstawa tej metody nie była już nowością w tamtych czasach: Międzynarodowy projekt „Ludzki genom” (HGP) wykorzystał tę samą sprytną metodę, którą opracował Fred Sanger w połowie lat 70. XX wieku. Innowacja polegała jednak na skali i stopniu automatyzacji, które udało się osiągnąć podczas sekwencjonowania.
Automatyczne sekwencjonowanie pierwotnie było opracowywane w laboratorium Lee Hooda w California Institute of Technology. Ukończył szkołę w stanie Montana i grał w futbol amerykański na pozycji napastnika; dzięki Hoodowi drużyna wielokrotnie zdobywała mistrzostwo stanu. Umiejętności pracy zespołowej przydały mu się również w karierze naukowej. W laboratorium Hooda pracowała różnorodna grupa chemików, biologów i inżynierów, a wkrótce jego laboratorium stało się liderem w dziedzinie innowacji technologicznych.
Metoda automatycznego sekwencjonowania została w rzeczywistości wynaleziona przez Lloyda Smitha i Mike'a Hunkapillera. Mike Hunkapiller, który wówczas pracował w laboratorium Huda, zwrócił się do Lloyda Smitha z propozycją ulepszonej metody sekwencjonowania, w której zasady każdego typu byłyby barwione na inny kolor. Taki pomysł mógłby czterokrotnie zwiększyć efektywność procesu Sangera. W metodzie Sangera podczas sekwencjonowania w każdej z czterech próbówek (zgodnie z liczbą zasad) z pomocą polimerazy DNA powstaje unikalny zestaw oligonukleotydów o różnej długości, zawierających sekwencję startera. Następnie do probówek dodawano formamid w celu rozdzielenia łańcuchów i przeprowadzano elektroforezę w żelu poliakrylamidowym na czterech ścieżkach. W wersji Smitha i Hunkapillera didesoksyrybonukleotydy oznaczano czterema różnymi barwnikami, a PCR przeprowadzano w jednej probówce. Następnie podczas elektroforezy w żelu poliakrylamidowym laser oświetlał określone miejsce żelu, co aktywowało barwniki, a detektor określał, który nukleotyd aktualnie migruje przez żel. Początkowo Smith był pesymistycznie nastawiony — obawiał się, że użycie bardzo małych dawek barwnika spowoduje, iż fragmenty nukleotydowe będą niedostrzegalne. Jednak po doskonałym opanowaniu technologii laserowych wkrótce znalazł rozwiązanie, wykorzystując specjalne barwniki fluorochromowe, które fluorescencją odpowiadają na działanie promieniowania laserowego.
(Pełna wersja — 4,08 MB) Małym drukiem: sekwencja DNA, zdekodowana za pomocą automatycznego sekwenatora, uzyskana z urządzenia do automatycznego sekwencjonowania. Każdemu kolorowi odpowiada jedna z czterech zasad
W klasycznej wersji metody Sangera jedna z nici analizowanego DNA służy jako matryca do syntezowania komplementarnej nici przez enzym DNA-polimerazę, a następnie sekwencje fragmentów DNA są sortowane w żelu według rozmiaru. Każdy fragment, który wchodzi w skład DNA podczas syntezy i pozwala następnie wizualizować produkty reakcji, jest oznaczany fluorescencyjnym barwnikiem odpowiadającym końcowemu nukleotydowi (czym zajmowano się na str. 124); w związku z tym fluorescencja tego fragmentu będzie identyfikatorem dla danego nukleotydu. Następnie wystarczy przeprowadzić detekcję i wizualizować produkty reakcji. Wyniki analizuje się za pomocą komputera i przedstawia w postaci sekwencji wielokolorowych szczytów, które odpowiadają czterem nukleotydom. Informacje są następnie przesyłane bezpośrednio do systemu informatycznego komputera, co eliminuje czasochłonny i czasem torturowany proces wprowadzania danych, który bardzo utrudniał sekwencjonowanie.
» Więcej szczegółów o książce można znaleźć na
»
»
Dla użytkowników Habr zniżka 25% przy użyciu kuponu — PCR
Źródło: habr.com
