W Kalifornii zmarł amerykański laureat Nagrody Nobla w dziedzinie chemii, Carey Mullis, w wieku 74 lat. Jak poinformowała jego żona, śmierć nastąpiła 7 sierpnia. Przyczyną była niewydolność serca i układu oddechowego spowodowana zapaleniem płuc.
O tym, jaki był jego wkład w biochemię i za co otrzymał Nagrodę Nobla, opowie nam sam James Watson — odkrywca molekuły DNA.
Fragment książki autorstwa Jamesa Watsona, Andrew Berry, Kevina Davisa.
DNA. Historia rewolucji genetycznej.
Rozdział 7. Genom człowieka. Scenariusz życia.
…
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) została wynaleziona w 1983 roku przez biochimika Kary'ego Mullisa, który pracował w firmie Cetus. Odkrycie tej reakcji było niezwykle istotne. Później Mullis wspominał: „Pewnego piątkowego wieczoru w kwietniu 1983 roku nagle mnie olśniło. Jechałem po oświetlonej księżycem krętej drodze górskiej w północnej Kalifornii, w okolicy lasów sekwojowych”. Ciekawe, że to właśnie w takiej sytuacji odwiedziła go inspiracja. I wcale nie chodzi o to, że północna Kalifornia ma specjalne drogi sprzyjające olśnieniu; po prostu jego przyjaciel pewnego razu widział, jak Mullis bezmyślnie pędził po oblodzonej drodze z ruchem w obie strony, co wcale go nie przerażało. Przyjaciel powiedział New York Times: „Mullis widział, że zginie, wjeżdżając w sekwoję. Dlatego niczego się nie boi za kierownicą, jeśli wzdłuż drogi nie rosną sekwoje”. Obecność sekwoi wzdłuż drogi sprawiała, że Mullis koncentrował się i… oto, olśnienie. Za swoje odkrycie w 1993 roku Mullis otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii, a od tego czasu stał się jeszcze bardziej ekscentryczny w swoich działaniach. Na przykład, jest zwolennikiem rewizjonistycznej teorii, że AIDS nie jest związane z HIV, co znacząco podważyło jego reputację i utrudniło pracę lekarzom.
PCR to dość prosta reakcja. Do jej przeprowadzenia potrzebujemy dwóch chemicznie syntetyzowanych starterów, komplementarnych do przeciwnych końców różnych nici wymaganego fragmentu DNA. Startery to krótkie fragmenty jednoniciowego DNA, każdy o długości około 20 par zasad. Cechą starterów jest to, że odpowiadają fragmentom DNA, które mają zostać amplifikowane, czyli matrycy DNA.
(Obrazek jest klikany) Kary Mullis, wynalazca PCR
Specyfika PCR polega na tworzeniu komplementarnych kompleksów pomiędzy matrycą a primerami, krótkimi syntetycznymi oligonukleotydami. Każdy z primerów jest komplementarny do jednej z nici podwójnej matrycy i wyznacza początek oraz koniec amplifikowanego fragmentu. Uzyskana "matryca" to całkowity genom, a naszym celem jest wydobycie interesujących nas fragmentów. Aby to osiągnąć, podwójną matrycę DNA podgrzewa się do 95 °C na kilka minut, żeby nici DNA się rozdzieliły. Etap ten nazywa się denaturacją, ponieważ niszczone są wiązania wodorowe pomiędzy dwiema nićmi DNA. Gdy nici się rozdzielą, temperatura zostaje obniżona, aby primery mogły połączyć się z jednoniciową matrycą. Polimeraza DNA rozpoczyna replikację DNA, łącząc się z fragmentem łańcucha nukleotydów. Enzym polimeraza DNA replikuje łańcuch matrycowy, używając primera jako wskazówki lub przykładu do kopiowania. W wyniku pierwszego cyklu otrzymujemy wielokrotne, sekwencyjne podwojenie określonego fragmentu DNA. Następnie powtarzamy tę procedurę. Po każdym cyklu otrzymujemy celowy fragment w podwójnej ilości. Po dwudziestu pięciu cyklach PCR (czyli mniej niż w ciągu dwóch godzin) mamy interesujący nas fragment DNA w liczbie, która przekracza wartość początkową 225 razy (to znaczy amplifikowaliśmy go około 34 miliony razy). W rzeczywistości na wejściu miała miejsce mieszanka primerów, matrycowego DNA, enzymu polimerazy DNA i wolnych zasad A, C, G i T, przy czym ilość specyficznego produktu reakcji (ograniczonego przez primery) wzrasta wykładniczo, a ilość „długich” kopii DNA liniowo, dlatego w produktach reakcji dominuje.
Amplifikacja wybranego fragmentu DNA: reakcja łańcuchowa polimerazy
Na początku używania PCR podstawowym problemem było to, że po każdym cyklu podgrzewania i schładzania należało dodawać do mieszaniny reakcyjnej DNA polimerazę, ponieważ traciła aktywność w temperaturze 95 °C. Dlatego trzeba było dodawać ją ponownie przed każdym z 25 cykli. Procedura przeprowadzania reakcji była stosunkowo nieefektywna, wymagała dużo czasu i enzymu polimerazy, a materiał ten jest dość kosztowny. Na szczęście matka natura przyszła z pomocą. Wiele zwierząt czuje się komfortowo w znacznie wyższych temperaturach niż 37 °C. Dlaczego jednak wartością 37 °C stała się dla nas tak istotna? To dlatego, że ta temperatura jest optymalna dla E. coli, z której pierwotnie pozyskiwano enzym polimerazę do PCR. W przyrodzie występują mikroorganizmy, których białka, na skutek milionów lat doboru naturalnego, stały się bardziej odporne na działanie wysokich temperatur. Zaproponowano wykorzystanie DNA polimeraz z bakterii termofilnych. Enzymy te okazały się termostabilne i były w stanie wytrzymać wiele cykli reakcji. Ich zastosowanie pozwoliło uprościć i zautomatyzować przeprowadzanie PCR. Jedna z pierwszych termostabilnych DNA polimeraz została wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus, żyjącej w gorących źródłach Parku Narodowego Yellowstone, i nazwano ją polimerazą Taq.
PCR szybko stała się kluczowym narzędziem w projekcie „Genom człowieka”. Generalnie proces nie różni się od tego, który opracował Mullis, po prostu został zautomatyzowany. Nie polegaliśmy już na grupie niezdarnych doktorantów, starannie przelewających krople cieczy do plastikowych probówek. W nowoczesnych laboratoriach zajmujących się badaniami molekularno-genetycznymi, ta praca wykonywana jest na zrobotyzowanych taśmach produkcyjnych. Roboty PCR zaangażowane w tak ogromny projekt jak „Genom człowieka” nieustannie pracują z wielkimi ilościami termostabilnej polimerazy. Niektórzy naukowcy pracujący nad projektem „Genom człowieka” byli oburzeni nieuzasadnionymi wysokimi opłatami, które dodaje do kosztu materiałów eksploatacyjnych właściciel patentu na PCR, europejski gigant przemysłowo-farmaceutyczny Hoffmann-LaRoche.
Innym «napędem» stała się sama metoda sekwencjonowania DNA. Chemiczna podstawa tej metody wówczas nie była nowością: Międzynarodowy projekt „Ludzki genom” (HGP) wykorzystał tę samą pomysłową metodę, którą w połowie lat 70. opracował Fred Sanger. Innowacja polegała na skali i stopniu automatyzacji, które udało się osiągnąć podczas sekwencjonowania.
Automatyczne sekwencjonowanie pierwotnie opracowywano w laboratorium Li Hooda w Kalifornijskim Instytucie Technologicznym. Ukończył szkołę w stanie Montana i grał w futbol amerykański na pozycji napastnika; dzięki Hoodowi drużyna wielokrotnie zdobywała tytuł mistrza stanu. Umiejętności zespołowej współpracy przydały mu się także w karierze naukowej. W laboratorium Hooda pracowała różnorodna grupa chemików, biologów i inżynierów, a wkrótce jego laboratorium stało się liderem w obszarze innowacji technologicznych.
Faktycznie metodę automatycznego sekwencjonowania wynaleźli Lloyd Smith i Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, który wówczas pracował w laboratorium Huda, zwrócił się do Lloyda Smitha z propozycją udoskonalonej metody sekwencjonowania, w której zasady każdego typu byłyby kolorowane na inny kolor. Taki pomysł mógłby zwiększyć wydajność metody Sangera czterokrotnie. W metodzie Sangera w każdej z czterech probówek (zgodnie z ilością zasad) w obecności polimerazy DNA powstaje unikalny zestaw oligonukleotydów o różnej długości zawierających sekwencję primera. Następnie do probówek dodawano formamid w celu rozdzielenia łańcuchów i przeprowadzano elektroforezę w żelu poliakryamidowym na czterech ścieżkach. W wersji Smitha i Hunkapillera didesoksyrybonukleotydy znakowane są czterema różnymi barwnikami i PCR odbywa się w jednej probówce. Następnie, podczas elektroforezy w żelu poliakryamidowym, wiązka lasera w określonym miejscu żelu wzbudza aktywność barwników, a detektor określa, który nukleotyd aktualnie migruje przez żel. Na początku Smith był nastawiony pesymistycznie — obawiał się, że użycie ultra-małych dawek barwnika sprawi, że fragmenty nukleotydowe będą nieczytelne. Jednak, doskonale znając technologie laserowe, szybko znalazł rozwiązanie, używając specjalnych fluorochromowych barwników, które fluorescencyjnie reagują na działanie promieniowania laserowego.
(Pełna wersja — 4,08 MB) Małym drukiem: sekwencja DNA, zdekodowana za pomocą automatycznego sekwenatora, uzyskana z urządzenia do automatycznego sekwencjonowania. Każdemu kolorowi odpowiada jedna z czterech zasad.
W klasycznej wersji metody Sangera jedna z nici analizowanego DNA pełni rolę matrycy do syntezy komplementarnej nici przez enzym polimerazę DNA, a następnie sekwencje fragmentów DNA są sortowane w żelu według rozmiaru. Każdy fragment, który wchodzi w skład DNA w trakcie syntezy i pozwala na późniejsze wizualizowanie produktów reakcji, jest oznaczany fluorescencyjnym barwnikiem odpowiadającym terminalnej zasadzie (o tym było mowa na s. 124); w związku z tym fluorescencja tego fragmentu stanie się identyfikatorem dla danej zasady. Następnie należy jedynie przeprowadzić detekcję i wizualizować produkty reakcji. Wyniki są analizowane za pomocą komputera i przedstawiają się w postaci sekwencji kolorowych szczytów, odpowiadających czterem nukleotydom. Informacje są następnie bezpośrednio przesyłane do systemu informacyjnego komputera, co eliminuje czasochłonny i czasami męczący proces wprowadzania danych, który znacznie komplikuje sekwencjonowanie.
» Szczegółowe informacje na temat książki można znaleźć na
»
»
Dla Habrz mieszkańców zniżka 25% z kuponem — PCR
Źródło: habr.com
