W Kalifornii w wieku 74 lat zmarł amerykański laureat Nagrody Nobla w dziedzinie chemii Kary Mullis. Według jego żony śmierć nastąpiła 7 sierpnia. Przyczyną jest niewydolność serca i układu oddechowego spowodowana zapaleniem płuc.
Sam James Watson, odkrywca cząsteczki DNA, opowie nam o wkładzie, jaki wniósł do biochemii i za który otrzymał Nagrodę Nobla.
Fragment książki Jamesa Watsona, Andrew Berry’ego i Kevina Davisa
DNA. Historia rewolucji genetycznej
Rozdział 7. Genom człowieka. Scenariusz życia
...
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) została wynaleziona w 1983 roku przez biochemika Careya Mullisa, który pracował w firmie Cetus. Odkrycie tej reakcji było dość niezwykłe. Mullis wspominał później: „Pewnego piątkowego wieczoru w kwietniu 1983 roku doznałem objawienia. Siedziałem za kierownicą i jechałem oświetloną księżycem krętą górską drogą w Północnej Kalifornii, krainie lasów sekwoi. Imponujące jest to, że właśnie w takiej sytuacji uderzyło go natchnienie. I nie jest tak, że w północnej Kalifornii znajdują się specjalne drogi sprzyjające wglądowi; po prostu jego przyjaciel kiedyś zobaczył Mullisa pędzącego lekkomyślnie po oblodzonej dwujezdniowej drodze i wcale mu to nie przeszkadzało. Przyjaciel powiedział dziennikowi „New York Times”: „Mullis miał wizję, że umrze, uderzając w sekwoję. Dlatego nie boi się niczego podczas jazdy, chyba że przy drodze rosną sekwoje”. Obecność sekwoi wzdłuż drogi zmusiła Mullisa do skupienia się i... oto pewien wgląd. Mullis otrzymał za swój wynalazek Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 1993 roku i od tego czasu jego działania stały się jeszcze dziwniejsze. Jest na przykład zwolennikiem rewizjonistycznej teorii, że AIDS nie ma związku z wirusem HIV, co znacząco podważyło jego reputację i przeszkadzało lekarzom.
PCR jest dość prostą reakcją. Aby to przeprowadzić, potrzebujemy dwóch chemicznie syntetyzowanych starterów, które są komplementarne do przeciwległych końców różnych nici wymaganego fragmentu DNA. Startery to krótkie odcinki jednoniciowego DNA, każdy o długości około 20 par zasad. Specyfiką starterów jest to, że odpowiadają one fragmentom DNA, które wymagają amplifikacji, czyli matrycy DNA.
(Obraz można kliknąć) Kary Mullis, wynalazca PCR
Specyficzność PCR opiera się na tworzeniu komplementarnych kompleksów pomiędzy matrycą a starterami, czyli krótkimi syntetycznymi oligonukleotydami. Każdy starter jest komplementarny do jednej z nici dwuniciowego szablonu i ogranicza początek i koniec amplifikowanego regionu. Tak naprawdę powstała „macierz” to cały genom, a naszym celem jest wyizolowanie z niego interesujących nas fragmentów. W tym celu dwuniciową matrycę DNA podgrzewa się do temperatury 95°C przez kilka minut w celu rozdzielenia nici DNA. Ten etap nazywa się denaturacją, ponieważ wiązania wodorowe pomiędzy dwiema niciami DNA zostają zerwane. Po rozdzieleniu nici temperaturę obniża się, aby umożliwić starterom związanie się z jednoniciową matrycą. Polimeraza DNA rozpoczyna replikację DNA poprzez związanie się z odcinkiem łańcucha nukleotydowego. Enzym polimeraza DNA replikuje nić matrycową przy użyciu startera jako startera lub przykładu do kopiowania. W wyniku pierwszego cyklu uzyskujemy wielokrotne, kolejne podwojenie określonego odcinka DNA. Następnie powtarzamy tę procedurę. Po każdym cyklu uzyskujemy powierzchnię docelową w podwójnej ilości. Po dwudziestu pięciu cyklach PCR (czyli w niecałe dwie godziny) mamy interesujący nas region DNA w ilości 225 razy większej niż oryginał (czyli amplifikowaliśmy go około 34 miliony razy). Tak naprawdę na wejściu otrzymaliśmy mieszaninę starterów, matrycy DNA, enzymu polimerazy DNA i wolnych zasad A, C, G i T, ilość konkretnego produktu reakcji (ograniczona przez startery) rośnie wykładniczo, a liczba „długich” kopii DNA jest liniowy, zatem w produktach reakcji dominują produkty.
Amplifikacja żądanego odcinka DNA: reakcja łańcuchowa polimerazy
Na początku PCR głównym problemem był następujący problem: po każdym cyklu ogrzewania i chłodzenia do mieszaniny reakcyjnej trzeba było dodawać polimerazę DNA, ponieważ inaktywowała się ona w temperaturze 95°C. Dlatego konieczne było jego ponowne dodanie przed każdym z 25 cykli. Procedura reakcji była stosunkowo nieefektywna, wymagała dużo czasu i enzymu polimerazy, a materiał był bardzo drogi. Na szczęście z pomocą przyszła Matka Natura. Wiele zwierząt czuje się komfortowo w temperaturach znacznie wyższych niż 37°C. Dlaczego liczba 37°C stała się dla nas ważna? Stało się tak, ponieważ ta temperatura jest optymalna dla E. coli, z której pierwotnie otrzymano enzym polimerazę do PCR. W przyrodzie występują mikroorganizmy, których białka w ciągu milionów lat doboru naturalnego stały się bardziej odporne na wysokie temperatury. Zaproponowano wykorzystanie polimeraz DNA pochodzących z bakterii termofilnych. Enzymy te okazały się termostabilne i były w stanie wytrzymać wiele cykli reakcji. Ich zastosowanie umożliwiło uproszczenie i automatyzację reakcji PCR. Jedną z pierwszych termostabilnych polimeraz DNA wyizolowano z bakterii Thermus aquaticus żyjącej w gorących źródłach Parku Narodowego Yellowstone i nazwano ją polimerazą Taq.
PCR szybko stał się głównym narzędziem projektu poznania ludzkiego genomu. Ogólnie proces nie różni się od tego opracowanego przez Mullisa, został po prostu zautomatyzowany. Nie byliśmy już zależni od tłumu niewidomych doktorantów skrupulatnie wlewających kropelki płynu do plastikowych probówek. W nowoczesnych laboratoriach prowadzących badania genetyki molekularnej prace te wykonywane są na zrobotyzowanych przenośnikach. Roboty PCR biorące udział w projekcie sekwencjonowania tak dużym jak genom ludzki pracują niestrudzenie z ogromnymi ilościami termostabilnej polimerazy. Niektórzy naukowcy pracujący nad projektem poznania genomu ludzkiego byli oburzeni nieracjonalnie wysokimi opłatami licencyjnymi dodawanymi do kosztów materiałów eksploatacyjnych przez właściciela patentu na PCR, europejskiego giganta branży farmaceutycznej Hoffmann-LaRoche.
Kolejną „zasadą napędową” była sama metoda sekwencjonowania DNA. Chemiczne podstawy tej metody nie były już wówczas nowe: w ramach Międzystanowego Projektu Genomu Ludzkiego (HGP) przyjęto tę samą genialną metodę, którą opracował Fred Sanger w połowie lat siedemdziesiątych. Innowacja polegała na skali i stopniu automatyzacji, jaki udało się osiągnąć dzięki sekwencjonowaniu.
Automatyczne sekwencjonowanie zostało pierwotnie opracowane w laboratorium Lee Hooda w California Institute of Technology. Uczęszczał do szkoły średniej w Montanie i grał w futbol uniwersytecki jako rozgrywający; Dzięki Hoodowi drużyna nie raz zdobyła mistrzostwo stanu. Umiejętności pracy zespołowej przydały się także w jego karierze naukowej. W laboratorium Hooda pracowała zróżnicowana załoga chemików, biologów i inżynierów, a jego laboratorium wkrótce stało się liderem innowacji technologicznych.
W rzeczywistości zautomatyzowaną metodę sekwencjonowania wynaleźli Lloyd Smith i Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, pracujący wówczas w laboratorium Hooda, zwrócił się do Lloyda Smitha z propozycją ulepszonej metody sekwencjonowania, w której każdy rodzaj zasady miałby inny kolor. Taki pomysł mógłby czterokrotnie zwiększyć efektywność procesu Sangera. U Sangera podczas sekwencjonowania w każdej z czterech probówek (według liczby zasad) przy udziale polimerazy DNA powstaje unikalny zestaw oligonukleotydów o różnej długości, zawierający sekwencję starterów. Następnie do probówek dodano formamid w celu rozdzielenia łańcuchów i przeprowadzono elektroforezę w żelu poliakryloamidowym na czterech ścieżkach. W wersji Smitha i Hunkapillera dideoksynukleotydy są znakowane czterema różnymi barwnikami, a PCR przeprowadza się w jednej probówce. Następnie podczas elektroforezy w żelu poliakryloamidowym wiązka lasera umieszczona w określonym miejscu na żelu pobudza aktywność barwników, a detektor określa, który nukleotyd aktualnie migruje przez żel. Początkowo Smith był pesymistą – obawiał się, że zastosowanie bardzo małych dawek barwnika doprowadzi do nierozróżnialności regionów nukleotydowych. Mając jednak doskonałą wiedzę na temat technologii laserowej, szybko znalazł wyjście z sytuacji, stosując specjalne barwniki fluorochromowe, które fluoryzują pod wpływem promieniowania laserowego.
(Pełna wersja - 4,08 MB) Drobnym drukiem: Sekwencja DNA zsekwencjonowana przy użyciu automatycznego sekwencera, uzyskana z automatycznej maszyny do sekwencjonowania. Każdy kolor odpowiada jednej z czterech baz
W klasycznej wersji metody Sangera jedna z nici analizowanego DNA pełni rolę matrycy do syntezy nici komplementarnej przez enzym polimerazę DNA, następnie sekwencja fragmentów DNA jest sortowana w żelu według wielkości. Każdy fragment, który zostaje włączony do DNA podczas syntezy i umożliwia późniejszą wizualizację produktów reakcji, jest znakowany barwnikiem fluorescencyjnym odpowiadającym zasadzie końcowej (było to omówione na s. 124); zatem fluorescencja tego fragmentu będzie identyfikatorem dla danej zasady. Następnie pozostaje tylko przeprowadzić detekcję i wizualizację produktów reakcji. Wyniki analizuje się komputerowo i przedstawia jako sekwencję wielobarwnych pików odpowiadających czterem nukleotydom. Informacje są następnie przesyłane bezpośrednio do systemu informatycznego komputera, co eliminuje czasochłonny i czasami bolesny proces wprowadzania danych, który bardzo utrudniał sekwencjonowanie.
» Więcej szczegółów na temat książki można znaleźć na stronie
»
»
Dla Khabrozhiteley 25% zniżki przy użyciu kuponu - PCR
Źródło: www.habr.com