O laureado americano com o Prêmio Nobel de Química, Kary Mullis, faleceu na Califórnia aos 74 anos. Segundo sua esposa, a morte ocorreu em 7 de agosto. A causa foi insuficiência cardíaca e respiratória devido à pneumonia.
Sobre a contribuição que ele fez à bioquímica e o motivo pelo qual recebeu o Prêmio Nobel, quem nos conta é o próprio James Watson — o descobridor da molécula de DNA.
Trecho do livro de James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. A história da revolução genética
Capítulo 7. O genoma humano. O roteiro da vida
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A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi inventada em 1983 pelo bioquímico Kary Mullis, que trabalhava na empresa Cetus. A descoberta dessa reação foi bastante notável. Mais tarde, Mullis lembrou-se: "Certa vez, numa noite de sexta-feira em abril de 1983, fui iluminado por uma ideia. Estava dirigindo por uma estrada sinuosa e iluminada pela lua no norte da Califórnia, nas proximidades das florestas de sequoias." É impressionante que foi nesse tipo de situação que a inspiração o visitou. E não é que as estradas do norte da Califórnia sejam especiais para iluminar; simplesmente, um amigo dele já o viu dirigir de forma imprudente por uma estrada congelada de mão dupla e isso não o perturbava. O amigo contou ao New York Times: "Mullis teve a visão de que morreria colidindo com uma sequoia. Portanto, ele não tem medo de dirigir, a menos que sequoias estejam ao longo da estrada." A presença de sequoias ao longo da estrada fazia Mullis se concentrar e… lá estava, a iluminação. Por sua invenção, em 1993, Mullis recebeu o Prêmio Nobel de Química e desde então tornou-se ainda mais excêntrico em suas ações. Por exemplo, ele é um defensor da teoria revisionista de que a AIDS não está relacionada ao HIV, o que prejudicou consideravelmente sua própria reputação e atrapalhou médicos.
A PCR é uma reação bastante simples. Para realizá-la, precisamos de dois primers sintéticos quimicamente, complementares às extremidades opostas das diferentes cadeias do fragmento de DNA desejado. Os primers são trechos curtos de DNA de fita simples, cada um com cerca de 20 pares de bases de comprimento. A característica dos primers é que eles se correspondem com as regiões do DNA que precisam ser amplificadas, ou seja, a matriz de DNA.
(A imagem é clicável) Kary Mullis, inventor da PCR
A especificidade da PCR baseia-se na formação de complexos complementares entre a matriz e os primers, que são oligonucleotídeos sintéticos curtos. Cada primer é complementar a uma das cadeias da matriz de dupla hélice e delimita o início e o fim da região que será amplificada. De fato, a "matriz" obtida representa um genoma intacto e nosso objetivo é isolar os fragmentos de nosso interesse. Para isso, a matriz de DNA de dupla cadeia é aquecida a 95 °C por alguns minutos, para que as cadeias de DNA se separem. Esta etapa é chamada de desnaturação, pois as ligações de hidrogênio entre as duas cadeias de DNA são rompidas. Quando as cadeias se separam, a temperatura é reduzida para que os primers possam se ligar à matriz de fita simples. A DNA polimerase inicia a replicação do DNA, ligando-se ao segmento de nucleotídeos. A enzima DNA polimerase replica a cadeia matriz, utilizando o primer como inicializador ou modelo para cópia. Como resultado do primeiro ciclo, obtemos uma duplicação sequencial múltipla de uma determinada região do DNA. Em seguida, repetimos esse processo. Após cada ciclo, obtemos a região-alvo em dobro. Após vinte e cinco ciclos de PCR (ou seja, em menos de duas horas), temos a região do DNA de nosso interesse em uma quantidade 225 vezes maior do que a original (ou seja, a amplificamos aproximadamente 34 milhões de vezes). De fato, a mistura inicial consistia de primers, DNA matriz, enzima DNA polimerase e bases livres A, C, G e T, a quantidade do produto específico da reação (limitado pelos primers) cresce exponencialmente, e a quantidade de cópias "longas" de DNA cresce linearmente, portanto, nos produtos da reação, o que predomina é.
Amplificação da região desejada do DNA: reação em cadeia da polimerase
No alvorecer da utilização da PCR, o principal problema era o seguinte: após cada ciclo de aquecimento-resfriamento, era necessário adicionar a DNA polimerase à mistura de reação, uma vez que ela se inativava a 95 °C. Portanto, era preciso adicioná-la novamente antes de cada um dos 25 ciclos. O procedimento de realizar a reação era relativamente ineficaz, exigia muito tempo e a enzima polimerase, e o material não é barato. Felizmente, a natureza veio em nosso auxílio. Muitos animais se sentem confortáveis a temperaturas muito superiores a 37 °C. E por que o número 37 °C se tornou importante para nós? Isso ocorreu porque essa temperatura é ótima para E. coli, de onde inicialmente se obtinha a enzima polimerase para PCR. Na natureza, existem microorganismos cujas proteínas, ao longo de milhões de anos de seleção natural, tornaram-se mais resistentes a altas temperaturas. Foi proposto o uso de DNA polimerases de bactérias termofílicas. Essas enzimas mostraram-se termostáveis e eram capazes de suportar múltiplos ciclos de reação. Seu uso permitiu simplificar e automatizar a execução da PCR. Uma das primeiras DNA polimerases termostáveis foi isolada da bactéria Thermus aquaticus, que habita em fontes termais do Parque Nacional de Yellowstone, e foi chamada de Taq polimerase.
A PCR rapidamente se tornou a principal ferramenta do projeto "Genoma Humano". De uma forma geral, o processo não difere do desenvolvido por Mullis, apenas foi automatizado. Não dependemos mais de um grupo de pós-graduandos míopes, vertendo gotículas de líquido em tubos de plástico com cuidado. Em laboratórios modernos que realizam pesquisas em genética molecular, esse trabalho é feito em linhas de produção robotizadas. Os robôs de PCR, envolvidos em um projeto em grande escala de sequenciamento como o "Genoma Humano", trabalham incansavelmente com enormes volumes de polimerase resistente ao calor. Alguns cientistas que trabalham no projeto "Genoma Humano" ficaram indignados com as taxas excessivamente altas que o proprietário da patente da PCR, o gigante farmacêutico europeu Hoffmann-LaRoche, adiciona ao custo dos materiais consumíveis.
Outro 'motor principal' foi o próprio método de sequenciamento de DNA. A base química desse método já não era novidade na época: o projeto intergovernamental do 'Projeto Genoma Humano' (HGP) adotou o mesmo método engenhoso desenvolvido por Fred Sanger no meio dos anos 70. A inovação estava na escala e no nível de automação alcançados no sequenciamento.
O sequenciamento automático foi originalmente desenvolvido no laboratório de Lee Hood no Instituto de Tecnologia da Califórnia. Ele se formou em uma escola no estado de Montana e jogou futebol americano na posição de atacante; graças a Hood, sua equipe ganhou o campeonato estadual várias vezes. As habilidades de trabalho em equipe foram úteis em sua carreira científica. No laboratório de Hood, havia uma variedade de químicos, biólogos e engenheiros, e logo seu laboratório se tornou um líder em inovações tecnológicas.
Na verdade, o método de sequenciamento automático foi inventado por Lloyd Smith e Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, que na época trabalhava no laboratório de Hood, contatou Lloyd Smith, propondo um método aprimorado de sequenciamento, onde as bases de cada tipo seriam coloridas de uma cor diferente. Essa ideia poderia aumentar a eficiência do processo de Sanger em quatro vezes. No método de Sanger, durante o sequenciamento em cada um dos quatro tubos (correspondente ao número de bases) e com a ajuda da DNA polimerase, é gerado um conjunto único de oligonucleotídeos de diferentes comprimentos, incluindo a sequência do primer. Em seguida, formamida era adicionada aos tubos para dissociar as cadeias, e eletroforese era realizada em um gel de poliacrilamida com quatro trilhas. Na versão de Smith e Hunkapiller, didesoxinucleotídeos são marcados com quatro corantes diferentes e a PCR é realizada em um único tubo. Durante a eletroforese no gel de poliacrilamida, um feixe de laser em um local específico do gel excita a atividade dos corantes, e o detector identifica qual nucleotídeo está atualmente migrando pelo gel. Inicialmente, Smith estava pessimista — ele temia que o uso de doses extremamente pequenas de corante resultasse em trechos nucleotídicos indistinguíveis. No entanto, sendo excelente em tecnologias de laser, logo encontrou uma solução, utilizando corantes fluorescentes especiais que fluorescem sob a ação da radiação laser.
(Versão completa — 4,08 MB) Em letras miúdas: sequência de DNA, decifrada usando um sequenciador automático, obtida de um dispositivo de sequenciamento automático. Cada cor corresponde a uma das quatro bases.
Na versão clássica do método de Sanger, uma das cadeias do DNA analisado atua como matriz para a síntese da cadeia complementar pela enzima DNA polimerase; em seguida, a sequência dos fragmentos de DNA é separada por tamanho em um gel. Cada fragmento que se incorpora ao DNA durante a síntese e possibilita, posteriormente, a visualização dos produtos da reação é marcado com um corante fluorescente, correspondente à base terminal (como mencionado na p. 124); portanto, a fluorescência desse fragmento servirá como identificador para essa base. Restará apenas realizar a detecção e visualizar os produtos da reação. Os resultados são analisados por meio de computador e apresentados como uma sequência de picos coloridos, correspondentes às quatro nucleotídeos. Em seguida, a informação é transmitida diretamente para o sistema de informação do computador, o que elimina o processo demorado e muitas vezes doloroso de entrada de dados, que dificultava bastante o sequenciamento.
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Fonte: habr.com
