A americana ganhadora do Nobel de química Kary Mullis morreu na Califórnia aos 74 anos. Segundo sua esposa, a morte ocorreu no dia 7 de agosto. A causa é insuficiência cardíaca e respiratória devido à pneumonia.
O próprio James Watson, o descobridor da molécula de DNA, nos contará sobre sua contribuição para a bioquímica e pela qual recebeu o Prêmio Nobel.
Trecho do livro de James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
ADN. História da Revolução Genética
Capítulo 7. Genoma humano. Cenário de vida
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A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi inventada em 1983 pelo bioquímico Carey Mullis, que trabalhava na Cetus. A descoberta desta reação foi bastante notável. Mullis lembrou mais tarde: “Numa sexta-feira à noite, em abril de 1983, tive uma epifania. Eu estava ao volante, dirigindo por uma estrada sinuosa e iluminada pela lua no norte da Califórnia, a terra das florestas de sequoias.” É impressionante que tenha sido em tal situação que a inspiração o atingiu. E não é que o norte da Califórnia tenha estradas especiais que promovam o conhecimento; é que uma vez seu amigo viu Mullis acelerando de forma imprudente ao longo de uma pista gelada de mão dupla e isso não o incomodou em nada. Um amigo disse ao New York Times: “Mullis teve uma visão de que morreria ao bater em uma sequoia. Portanto, ele não tem medo de nada enquanto dirige, a menos que haja sequoias crescendo ao longo da estrada.” A presença de sequoias ao longo da estrada forçou Mullis a se concentrar e... aqui estava, uma visão. Mullis recebeu o Prêmio Nobel de Química por sua invenção em 1993 e desde então tornou-se ainda mais estranho em suas ações. Por exemplo, ele apoia a teoria revisionista de que a SIDA não está relacionada com o VIH, o que minou significativamente a sua própria reputação e interferiu com os médicos.
PCR é uma reação bastante simples. Para realizá-lo, precisamos de dois iniciadores sintetizados quimicamente que sejam complementares às extremidades opostas de diferentes fitas do fragmento de DNA necessário. Primers são seções curtas de DNA de fita simples, cada uma com cerca de 20 pares de bases de comprimento. A peculiaridade dos primers é que eles correspondem às seções de DNA que precisam ser amplificadas, ou seja, o molde de DNA.
(Imagem clicável) Kary Mullis, inventora do PCR
A especificidade da PCR baseia-se na formação de complexos complementares entre o molde e os iniciadores, oligonucleótidos sintéticos curtos. Cada primer é complementar a uma das fitas do molde de fita dupla e limita o início e o fim da região amplificada. Na verdade, a “matriz” resultante é um genoma completo, e nosso objetivo é isolar dele os fragmentos que nos interessam. Para fazer isso, o modelo de DNA de fita dupla é aquecido a 95 °C durante vários minutos para separar as fitas de DNA. Este estágio é chamado de desnaturação porque as ligações de hidrogênio entre as duas fitas de DNA são quebradas. Uma vez separadas as cadeias, a temperatura é reduzida para permitir que os iniciadores se liguem ao modelo de cadeia simples. A DNA polimerase inicia a replicação do DNA ligando-se a um trecho da cadeia de nucleotídeos. A enzima DNA polimerase replica a fita modelo usando um primer como primer ou exemplo para cópia. Como resultado do primeiro ciclo, obtemos múltiplas duplicações sequenciais de uma determinada seção de DNA. A seguir repetimos este procedimento. Após cada ciclo obtemos uma área alvo em quantidade dupla. Após vinte e cinco ciclos de PCR (ou seja, em menos de duas horas), temos a região do DNA que nos interessa em uma quantidade 225 vezes maior que a original (ou seja, a amplificamos aproximadamente 34 milhões de vezes). Na verdade, na entrada recebemos uma mistura de primers, DNA molde, a enzima DNA polimerase e bases livres A, C, G e T, a quantidade de um produto de reação específico (limitado pelos primers) cresce exponencialmente, e o número de cópias “longas” de DNA é linear, portanto, os produtos de reação dominam.
Amplificação da seção de DNA desejada: reação em cadeia da polimerase
Nos primórdios da PCR, o principal problema era o seguinte: após cada ciclo de aquecimento-resfriamento, era necessário adicionar DNA polimerase à mistura reacional, pois ela era inativada a uma temperatura de 95°C. Portanto, foi necessário adicioná-lo novamente antes de cada um dos 25 ciclos. O procedimento de reação foi relativamente ineficiente, exigiu muito tempo e a enzima polimerase, e o material era muito caro. Felizmente, a Mãe Natureza veio em socorro. Muitos animais sentem-se confortáveis a temperaturas muito superiores a 37 °C. Por que o número de 37 °C se tornou importante para nós? Isso aconteceu porque essa temperatura é ótima para E. coli, da qual foi originalmente obtida a enzima polimerase para PCR. Na natureza existem microrganismos cujas proteínas, ao longo de milhões de anos de seleção natural, tornaram-se mais resistentes às altas temperaturas. Foi proposto o uso de DNA polimerases de bactérias termofílicas. Essas enzimas revelaram-se termoestáveis e capazes de resistir a muitos ciclos de reação. A sua utilização permitiu simplificar e automatizar a PCR. Uma das primeiras DNA polimerases termoestáveis foi isolada da bactéria Thermus aquaticus, que vive nas fontes termais do Parque Nacional de Yellowstone, e foi batizada de Taq polimerase.
A PCR rapidamente se tornou o carro-chefe do Projeto Genoma Humano. Em geral, o processo não difere daquele desenvolvido por Mullis, apenas foi automatizado. Não dependíamos mais de uma multidão de estudantes de pós-graduação estúpidos que despejavam meticulosamente gotas de líquido em tubos de ensaio de plástico. Nos laboratórios modernos que realizam pesquisas genéticas moleculares, esse trabalho é realizado em transportadores robóticos. Os robôs PCR envolvidos num projeto de sequenciação tão grande como o Genoma Humano trabalham incansavelmente com enormes volumes de polimerase estável ao calor. Alguns cientistas que trabalham no Projecto Genoma Humano ficaram indignados com os royalties excessivamente elevados acrescentados ao custo dos consumíveis pelo proprietário da patente PCR, o gigante industrial farmacêutico europeu Hoffmann-LaRoche.
Outro “princípio motriz” foi o próprio método de sequenciamento de DNA. A base química deste método já não era nova naquela época: o Projeto Interestadual do Genoma Humano (HGP) adotou o mesmo método engenhoso que Fred Sanger havia desenvolvido em meados da década de 1970. A inovação reside na escala e no grau de automação que o sequenciamento foi capaz de alcançar.
O sequenciamento automatizado foi originalmente desenvolvido no laboratório de Lee Hood no Instituto de Tecnologia da Califórnia. Ele cursou o ensino médio em Montana e jogou futebol americano universitário como zagueiro; Graças a Hood, o time conquistou o campeonato estadual mais de uma vez. Suas habilidades de trabalho em equipe também foram úteis em sua carreira científica. O laboratório de Hood era composto por uma equipe heterogênea de químicos, biólogos e engenheiros, e seu laboratório logo se tornou líder em inovação tecnológica.
Na verdade, o método de sequenciamento automatizado foi inventado por Lloyd Smith e Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, que então trabalhava no laboratório de Hood, abordou Lloyd Smith com uma proposta para um método de sequenciamento aprimorado no qual cada tipo de base teria uma cor diferente. Tal ideia poderia quadruplicar a eficiência do processo Sanger. Em Sanger, ao sequenciar em cada um dos quatro tubos (de acordo com o número de bases), com a participação da DNA polimerase, forma-se um conjunto único de oligonucleotídeos de diferentes comprimentos, incluindo uma sequência de primers. Em seguida, adicionou-se formamida aos tubos para separação das cadeias e realizou-se eletroforese em gel de poliacrilamida em quatro pistas. Na versão de Smith e Hunkapiller, os didesoxinucleotídeos são marcados com quatro corantes diferentes e a PCR é realizada em um tubo. Então, durante a eletroforese em gel de poliacrilamida, um feixe de laser em um local específico do gel excita a atividade dos corantes e o detector determina qual nucleotídeo está atualmente migrando através do gel. No início, Smith estava pessimista - ele temia que o uso de doses ultrabaixas de corante tornaria as regiões de nucleotídeos indistinguíveis. No entanto, tendo um excelente conhecimento da tecnologia laser, ele logo encontrou uma saída para a situação usando corantes fluorocromos especiais que ficam fluorescentes quando expostos à radiação laser.
(Versão completa - 4,08 MB) Letras miúdas: Sequência de DNA sequenciada usando um sequenciador automático, obtida de uma máquina de sequenciamento automático. Cada cor corresponde a uma das quatro bases
Na versão clássica do método Sanger, uma das fitas do DNA analisado atua como molde para a síntese de uma fita complementar pela enzima DNA polimerase, então a sequência de fragmentos de DNA é classificada em um gel por tamanho. Cada fragmento, que é incluído no DNA durante a síntese e permite a visualização posterior dos produtos da reação, é marcado com um corante fluorescente correspondente à base terminal (isso foi discutido na pág. 124); portanto, a fluorescência deste fragmento será um identificador para uma determinada base. Então resta realizar a detecção e visualizar os produtos da reação. Os resultados são analisados por computador e apresentados como uma sequência de picos multicoloridos correspondentes a quatro nucleotídeos. A informação é então transferida diretamente para o sistema de informação do computador, eliminando o demorado e às vezes penoso processo de entrada de dados que dificultava muito o sequenciamento.
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Fonte: habr.com