{"id":37174,"date":"2019-10-31T22:16:11","date_gmt":"2019-10-31T19:16:11","guid":{"rendered":"https:\/\/prohoster.info\/blog\/umer-nobelevskij-laureat-keri-mullis-izobretatel-polimeraznoj-tsepnoj-reaktsii-dnk\/"},"modified":"2019-10-31T22:16:11","modified_gmt":"2019-10-31T19:16:11","slug":"umer-nobelevskij-laureat-keri-mullis-izobretatel-polimeraznoj-tsepnoj-reaktsii-dnk","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/prohoster.info\/pt\/blog\/news\/umer-nobelevskij-laureat-keri-mullis-izobretatel-polimeraznoj-tsepnoj-reaktsii-dnk","title":{"rendered":"Faleceu o laureado com o Nobel Carey Mullis \u2014 inventor da rea\u00e7\u00e3o em cadeia da polimerase do DNA","gt_translate_keys":[{"key":"rendered","format":"text"}]},"content":{"rendered":"

\"Faleceu O laureado americano com o Pr\u00eamio Nobel de Qu\u00edmica, Kary Mullis, faleceu na Calif\u00f3rnia aos 74 anos. Segundo sua esposa, a morte ocorreu em 7 de agosto. A causa foi insufici\u00eancia card\u00edaca e respirat\u00f3ria devido \u00e0 pneumonia.<\/p>\n

Sobre a contribui\u00e7\u00e3o que ele fez \u00e0 bioqu\u00edmica e o motivo pelo qual recebeu o Pr\u00eamio Nobel, quem nos conta \u00e9 o pr\u00f3prio James Watson \u2014 o descobridor da mol\u00e9cula de DNA. <\/p>\n

Trecho do livro de James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis <\/p>\n

DNA. A hist\u00f3ria da revolu\u00e7\u00e3o gen\u00e9tica<\/h2>\n

Cap\u00edtulo 7. O genoma humano. O roteiro da vida<\/h3>\n

\n<\/a><\/noindex>
\n\u2026
\nA rea\u00e7\u00e3o em cadeia da polimerase (PCR) foi inventada em 1983 pelo bioqu\u00edmico Kary Mullis, que trabalhava na empresa Cetus. A descoberta dessa rea\u00e7\u00e3o foi bastante not\u00e1vel. Mais tarde, Mullis lembrou-se: \"Certa vez, numa noite de sexta-feira em abril de 1983, fui iluminado por uma ideia. Estava dirigindo por uma estrada sinuosa e iluminada pela lua no norte da Calif\u00f3rnia, nas proximidades das florestas de sequoias.\" \u00c9 impressionante que foi nesse tipo de situa\u00e7\u00e3o que a inspira\u00e7\u00e3o o visitou. E n\u00e3o \u00e9 que as estradas do norte da Calif\u00f3rnia sejam especiais para iluminar; simplesmente, um amigo dele j\u00e1 o viu dirigir de forma imprudente por uma estrada congelada de m\u00e3o dupla e isso n\u00e3o o perturbava. O amigo contou ao New York Times: \"Mullis teve a vis\u00e3o de que morreria colidindo com uma sequoia. Portanto, ele n\u00e3o tem medo de dirigir, a menos que sequoias estejam ao longo da estrada.\" A presen\u00e7a de sequoias ao longo da estrada fazia Mullis se concentrar e\u2026 l\u00e1 estava, a ilumina\u00e7\u00e3o. Por sua inven\u00e7\u00e3o, em 1993, Mullis recebeu o Pr\u00eamio Nobel de Qu\u00edmica e desde ent\u00e3o tornou-se ainda mais exc\u00eantrico em suas a\u00e7\u00f5es. Por exemplo, ele \u00e9 um defensor da teoria revisionista de que a AIDS n\u00e3o est\u00e1 relacionada ao HIV, o que prejudicou consideravelmente sua pr\u00f3pria reputa\u00e7\u00e3o e atrapalhou m\u00e9dicos.<\/p>\n

A PCR \u00e9 uma rea\u00e7\u00e3o bastante simples. Para realiz\u00e1-la, precisamos de dois primers sint\u00e9ticos quimicamente, complementares \u00e0s extremidades opostas das diferentes cadeias do fragmento de DNA desejado. Os primers s\u00e3o trechos curtos de DNA de fita simples, cada um com cerca de 20 pares de bases de comprimento. A caracter\u00edstica dos primers \u00e9 que eles se correspondem com as regi\u00f5es do DNA que precisam ser amplificadas, ou seja, a matriz de DNA. <\/p>\n

\"Faleceu<\/a><\/noindex>
\n(A imagem \u00e9 clic\u00e1vel) Kary Mullis, inventor da PCR<\/i><\/p>\n

A especificidade da PCR baseia-se na forma\u00e7\u00e3o de complexos complementares entre a matriz e os primers, que s\u00e3o oligonucleot\u00eddeos sint\u00e9ticos curtos. Cada primer \u00e9 complementar a uma das cadeias da matriz de dupla h\u00e9lice e delimita o in\u00edcio e o fim da regi\u00e3o que ser\u00e1 amplificada. De fato, a \"matriz\" obtida representa um genoma intacto e nosso objetivo \u00e9 isolar os fragmentos de nosso interesse. Para isso, a matriz de DNA de dupla cadeia \u00e9 aquecida a 95 \u00b0C por alguns minutos, para que as cadeias de DNA se separem. Esta etapa \u00e9 chamada de desnatura\u00e7\u00e3o, pois as liga\u00e7\u00f5es de hidrog\u00eanio entre as duas cadeias de DNA s\u00e3o rompidas. Quando as cadeias se separam, a temperatura \u00e9 reduzida para que os primers possam se ligar \u00e0 matriz de fita simples. A DNA polimerase inicia a replica\u00e7\u00e3o do DNA, ligando-se ao segmento de nucleot\u00eddeos. A enzima DNA polimerase replica a cadeia matriz, utilizando o primer como inicializador ou modelo para c\u00f3pia. Como resultado do primeiro ciclo, obtemos uma duplica\u00e7\u00e3o sequencial m\u00faltipla de uma determinada regi\u00e3o do DNA. Em seguida, repetimos esse processo. Ap\u00f3s cada ciclo, obtemos a regi\u00e3o-alvo em dobro. Ap\u00f3s vinte e cinco ciclos de PCR (ou seja, em menos de duas horas), temos a regi\u00e3o do DNA de nosso interesse em uma quantidade 225 vezes maior do que a original (ou seja, a amplificamos aproximadamente 34 milh\u00f5es de vezes). De fato, a mistura inicial consistia de primers, DNA matriz, enzima DNA polimerase e bases livres A, C, G e T, a quantidade do produto espec\u00edfico da rea\u00e7\u00e3o (limitado pelos primers) cresce exponencialmente, e a quantidade de c\u00f3pias \"longas\" de DNA cresce linearmente, portanto, nos produtos da rea\u00e7\u00e3o, o que predomina \u00e9.<\/p>\n

\"Faleceu
\nAmplifica\u00e7\u00e3o da regi\u00e3o desejada do DNA: rea\u00e7\u00e3o em cadeia da polimerase<\/i><\/p>\n

No alvorecer da utiliza\u00e7\u00e3o da PCR, o principal problema era o seguinte: ap\u00f3s cada ciclo de aquecimento-resfriamento, era necess\u00e1rio adicionar a DNA polimerase \u00e0 mistura de rea\u00e7\u00e3o, uma vez que ela se inativava a 95 \u00b0C. Portanto, era preciso adicion\u00e1-la novamente antes de cada um dos 25 ciclos. O procedimento de realizar a rea\u00e7\u00e3o era relativamente ineficaz, exigia muito tempo e a enzima polimerase, e o material n\u00e3o \u00e9 barato. Felizmente, a natureza veio em nosso aux\u00edlio. Muitos animais se sentem confort\u00e1veis a temperaturas muito superiores a 37 \u00b0C. E por que o n\u00famero 37 \u00b0C se tornou importante para n\u00f3s? Isso ocorreu porque essa temperatura \u00e9 \u00f3tima para E. coli, de onde inicialmente se obtinha a enzima polimerase para PCR. Na natureza, existem microorganismos cujas prote\u00ednas, ao longo de milh\u00f5es de anos de sele\u00e7\u00e3o natural, tornaram-se mais resistentes a altas temperaturas. Foi proposto o uso de DNA polimerases de bact\u00e9rias termof\u00edlicas. Essas enzimas mostraram-se termost\u00e1veis e eram capazes de suportar m\u00faltiplos ciclos de rea\u00e7\u00e3o. Seu uso permitiu simplificar e automatizar a execu\u00e7\u00e3o da PCR. Uma das primeiras DNA polimerases termost\u00e1veis foi isolada da bact\u00e9ria Thermus aquaticus, que habita em fontes termais do Parque Nacional de Yellowstone, e foi chamada de Taq polimerase.<\/p>\n

A PCR rapidamente se tornou a principal ferramenta do projeto \"Genoma Humano\". De uma forma geral, o processo n\u00e3o difere do desenvolvido por Mullis, apenas foi automatizado. N\u00e3o dependemos mais de um grupo de p\u00f3s-graduandos m\u00edopes, vertendo got\u00edculas de l\u00edquido em tubos de pl\u00e1stico com cuidado. Em laborat\u00f3rios modernos que realizam pesquisas em gen\u00e9tica molecular, esse trabalho \u00e9 feito em linhas de produ\u00e7\u00e3o robotizadas. Os rob\u00f4s de PCR, envolvidos em um projeto em grande escala de sequenciamento como o \"Genoma Humano\", trabalham incansavelmente com enormes volumes de polimerase resistente ao calor. Alguns cientistas que trabalham no projeto \"Genoma Humano\" ficaram indignados com as taxas excessivamente altas que o propriet\u00e1rio da patente da PCR, o gigante farmac\u00eautico europeu Hoffmann-LaRoche, adiciona ao custo dos materiais consum\u00edveis.<\/p>\n

Outro 'motor principal' foi o pr\u00f3prio m\u00e9todo de sequenciamento de DNA. A base qu\u00edmica desse m\u00e9todo j\u00e1 n\u00e3o era novidade na \u00e9poca: o projeto intergovernamental do 'Projeto Genoma Humano' (HGP) adotou o mesmo m\u00e9todo engenhoso desenvolvido por Fred Sanger no meio dos anos 70. A inova\u00e7\u00e3o estava na escala e no n\u00edvel de automa\u00e7\u00e3o alcan\u00e7ados no sequenciamento.<\/p>\n

O sequenciamento autom\u00e1tico foi originalmente desenvolvido no laborat\u00f3rio de Lee Hood no Instituto de Tecnologia da Calif\u00f3rnia. Ele se formou em uma escola no estado de Montana e jogou futebol americano na posi\u00e7\u00e3o de atacante; gra\u00e7as a Hood, sua equipe ganhou o campeonato estadual v\u00e1rias vezes. As habilidades de trabalho em equipe foram \u00fateis em sua carreira cient\u00edfica. No laborat\u00f3rio de Hood, havia uma variedade de qu\u00edmicos, bi\u00f3logos e engenheiros, e logo seu laborat\u00f3rio se tornou um l\u00edder em inova\u00e7\u00f5es tecnol\u00f3gicas.<\/p>\n

Na verdade, o m\u00e9todo de sequenciamento autom\u00e1tico foi inventado por Lloyd Smith e Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, que na \u00e9poca trabalhava no laborat\u00f3rio de Hood, contatou Lloyd Smith, propondo um m\u00e9todo aprimorado de sequenciamento, onde as bases de cada tipo seriam coloridas de uma cor diferente. Essa ideia poderia aumentar a efici\u00eancia do processo de Sanger em quatro vezes. No m\u00e9todo de Sanger, durante o sequenciamento em cada um dos quatro tubos (correspondente ao n\u00famero de bases) e com a ajuda da DNA polimerase, \u00e9 gerado um conjunto \u00fanico de oligonucleot\u00eddeos de diferentes comprimentos, incluindo a sequ\u00eancia do primer. Em seguida, formamida era adicionada aos tubos para dissociar as cadeias, e eletroforese era realizada em um gel de poliacrilamida com quatro trilhas. Na vers\u00e3o de Smith e Hunkapiller, didesoxinucleot\u00eddeos s\u00e3o marcados com quatro corantes diferentes e a PCR \u00e9 realizada em um \u00fanico tubo. Durante a eletroforese no gel de poliacrilamida, um feixe de laser em um local espec\u00edfico do gel excita a atividade dos corantes, e o detector identifica qual nucleot\u00eddeo est\u00e1 atualmente migrando pelo gel. Inicialmente, Smith estava pessimista \u2014 ele temia que o uso de doses extremamente pequenas de corante resultasse em trechos nucleot\u00eddicos indistingu\u00edveis. No entanto, sendo excelente em tecnologias de laser, logo encontrou uma solu\u00e7\u00e3o, utilizando corantes fluorescentes especiais que fluorescem sob a a\u00e7\u00e3o da radia\u00e7\u00e3o laser.<\/p>\n

\"Faleceu
\n(Vers\u00e3o completa ao clicar<\/a><\/noindex> \u2014 4,08 MB) Em letras mi\u00fadas: sequ\u00eancia de DNA, decifrada usando um sequenciador autom\u00e1tico, obtida de um dispositivo de sequenciamento autom\u00e1tico. Cada cor corresponde a uma das quatro bases.<\/i> <\/p>\n

Na vers\u00e3o cl\u00e1ssica do m\u00e9todo de Sanger, uma das cadeias do DNA analisado atua como matriz para a s\u00edntese da cadeia complementar pela enzima DNA polimerase; em seguida, a sequ\u00eancia dos fragmentos de DNA \u00e9 separada por tamanho em um gel. Cada fragmento que se incorpora ao DNA durante a s\u00edntese e possibilita, posteriormente, a visualiza\u00e7\u00e3o dos produtos da rea\u00e7\u00e3o \u00e9 marcado com um corante fluorescente, correspondente \u00e0 base terminal (como mencionado na p. 124); portanto, a fluoresc\u00eancia desse fragmento servir\u00e1 como identificador para essa base. Restar\u00e1 apenas realizar a detec\u00e7\u00e3o e visualizar os produtos da rea\u00e7\u00e3o. Os resultados s\u00e3o analisados por meio de computador e apresentados como uma sequ\u00eancia de picos coloridos, correspondentes \u00e0s quatro nucleot\u00eddeos. Em seguida, a informa\u00e7\u00e3o \u00e9 transmitida diretamente para o sistema de informa\u00e7\u00e3o do computador, o que elimina o processo demorado e muitas vezes doloroso de entrada de dados, que dificultava bastante o sequenciamento.<\/p>\n

\u00bb Voc\u00ea pode se aprofundar no livro em site da editora<\/a><\/noindex>
\n\u00bb \u00cdndice<\/a><\/noindex>
\n\u00bb Trecho<\/a><\/noindex><\/p>\n

Para os moradores do Habr, desconto de 25% com o cupom \u2014 PCR<\/b>
\n
Fonte: habr.com<\/a><\/p>","protected":false,"gt_translate_keys":[{"key":"rendered","format":"html"}]},"excerpt":{"rendered":"

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