În California, la vârsta de 74 de ani, a murit laureatul american al Premiului Nobel pentru chimie, Carey Mullis. Potrivit soției sale, decesul a avut loc pe 7 august. Cauza a fost insuficiență cardiacă și respiratorie din cauza pneumoniei.
Despre contribuția sa în biochimie și motivul pentru care a primit Premiul Nobel ne va povesti chiar James Watson — descoperitorul moleculei de ADN.
Fragment din cartea lui James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
ADN. Istoria revoluției genetice
Capitolul 7. Genomul uman. Scenariul vieții
…
Reacția de polimerizare a lanțului (PCR) a fost inventată în 1983 de biochimistul Carey Mullis, care lucra pentru compania Cetus. Descoperirea acestei reacții a fost deosebit de notabilă. Ulterior, Mullis a rememorat: „Într-o seară de vineri, în aprilie 1983, m-a lovit ca un flash. Eram la volan, rulând pe un drum de munte întortocheat, luminat de lună, în California de Nord, țara pădurilor de secuoya.” Este impresionant că inspirația l-a vizitat în acea situație. Și nu este vorba că drumurile din California de Nord sunt speciale, favorabile inspirației; pur și simplu, un prieten de-al său a văzut odată cum Mullis se îndrepta fără grijă pe o șosea înghețată cu circulație în ambele sensuri și acest lucru nu-l deranja deloc. Prietenul a spus ziarului New York Times: „Mullis a avut viziunea că va muri într-un accident cu o secuoya. Așa că nu-i este frică la volan, atâta timp cât pe marginea drumului nu cresc secuoyas.” Prezența secuoyas pe marginea drumului îl obliga pe Mullis să se concentreze și… așa a venit inspirația. Pentru invenția sa, în 1993, Mullis a primit Premiul Nobel pentru chimie, iar de atunci a devenit și mai excentric în comportamentul său. De exemplu, el susține teoria revizionistă că SIDA nu este legată de HIV, ceea ce i-a subminat semnificativ propria reputație și a împiedicat medicii.
PCR este o reacție destul de simplă. Pentru a o efectua, avem nevoie de doi primers sintetizați chimic, complementari la capetele opuse ale diferitelor lanțuri ale fragmentului de ADN necesar. Primerele sunt secvențe scurte de ADN monocatenar, fiecare având aproximativ 20 de perechi de baze în lungime. Caracteristica primelor este că acestea corespund secvențelor de ADN care trebuie amplificate, adică matricei ADN.
(Imaginea este clicabilă) Carey Mullis, inventatorul PCR
Specificitatea PCR se bazează pe formarea complexelor complementare între matrice și primeri, scurte oligonucleotide sintetice. Fiecare dintre primeri este complementară uneia dintre lanțurile matricei cu două fire și delimitează începutul și sfârșitul secvenței amplificabile. Practic, matricea obținută reprezintă un genom întreg, iar scopul nostru este de a extrage fragmentele de interes din ea. Pentru aceasta, matricea de ADN cu două fire este încălzită la 95 °C timp de câteva minute pentru a separa lanțurile de ADN. Această etapă se numește denaturare, deoarece legăturile de hidrogen dintre cele două lanțuri de ADN sunt distruse. După ce lanțurile sunt separate, temperatura este redusă pentru ca primerii să se poată lega de matricea cu un singur fir. ADN-polimeraza începe replicarea ADN-ului, legându-se de segmentul lanțului de nucleotide. Fermentul ADN-polimeraza replică lanțul matricei, folosind primerul ca model sau ca exemplu pentru copiere. Ca urmare a primului ciclu, obținem o dublare secvențială a unei anumite secțiuni de ADN. Apoi repetăm această procedură. După fiecare ciclu, obținem secțiunea țintă într-o cantitate dublă. După douăzeci și cinci de cicluri PCR (adică în mai puțin de două ore) avem secțiunea de ADN dorită într-o cantitate de 225 de ori mai mare decât inițial (adică am amplificat-o de aproximativ 34 de milioane de ori). Practic, la intrare aveam un amestec de primeri, ADN matrice, ferment ADN-polimeraza și baze libere A, C, G și T, iar cantitatea de produs specific al reacției (limitata de primeri) crește exponențial, în timp ce cantitatea de copii „lungi” de ADN crește linear, astfel că în produsele reacției predomină.
Amplificarea secțiunii dorite de ADN: reacția de polimerază în lanț
La începutul utilizării PCR, principala problemă consta în faptul că, după fiecare ciclu de încălzire-răcire, trebuia adăugat în amestecul de reacție ADN polimeraza, deoarece aceasta se inactivaba la temperatura de 95 °C. De aceea, era necesar să o adăugăm din nou înainte de fiecare dintre cele 25 de cicluri. Procedura de realizare a reacției era relativ ineficientă, necesita mult timp și polimeraza era un material destul de costisitor. Din fericire, natura ne-a venit în ajutor. Multe animale se simt bine la temperaturi mult mai mari de 37 °C. Și de ce a devenit importantă pentru noi cifra de 37 °C? Acest lucru s-a întâmplat deoarece această temperatură este optimă pentru E. coli, din care inițial se obținea enzima polimerazică pentru PCR. În natură există microorganisme ale căror proteine, după milioane de ani de selecție naturală, au devenit mai rezistente la acțiunea temperaturilor ridicate. S-a propus utilizarea ADN polimerazelor din bacterii termofile. Aceste enzime s-au dovedit a fi termostabile și au fost capabile să reziste la numeroase cicluri de reacție. Utilizarea lor a simplificat și automatizat realizarea PCR-ului. Una dintre primele ADN polimeraze termostabile a fost izolată din bacteria Thermus aquaticus, care trăiește în izvoarele termale ale Parcului Național Yellowstone, și a fost numită polimeraza Taq.
PCR a devenit rapid calul de bătaie principal al proiectului „Genomul uman”. În esență, procesul nu diferă de cel dezvoltat de Mullis, doar că a fost automatizat. Nu mai depindeam de o mulțime de studenți robi, care turnau cu grijă picături de lichid în eprubete de plastic. În laboratoarele moderne care efectuează cercetări moleculare și genice, această muncă este realizată pe linii de producție robotică. Roboții PCR, implicați într-un astfel de proiect de amploare cum este „Genomul uman”, lucrează neobosiți cu volume imense de polimerază rezistentă la căldură. Unii cercetători care lucrează în proiectul „Genomul uman” au fost indignați de redevențele nejustificat de mari pe care le adaugă la costul materialelor consumabile deținătorul patentului pentru PCR, gigantul european din industria farmaceutică Hoffmann-LaRoche.
Un alt „motor“ a fost metoda de secvențiere a ADN-ului. Fundamentul chimic al acestei metode nu mai era o nouă descoperire: proiectul internațional „Genome uman” (HGP) a îmbrățișat aceeași metodă ingenioasă dezvoltată de Fred Sanger în mijlocul anilor 1970. Inovația consta în amploarea și gradul de automatizare realizate în procesul de secvențiere.
Secvențierea automată a fost inițial dezvoltată în laboratorul lui Lee Hood de la California Institute of Technology. El a absolvit liceul în Montana și a jucat fotbal american în poziția de atacant; datorită lui Hood, echipa a câștigat de mai multe ori campionatul statului. Abilitățile sale de colaborare în echipă s-au dovedit utile și în cariera sa științifică. În laboratorul lui Hood lucra o echipă diversificată de chimiști, biologi și ingineri, iar în curând laboratorul său a devenit lider în inovații tehnologice.
De fapt, metoda de secvențiere automată a fost inventată de Lloyd Smith și Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, care lucra la laboratorul Hood, i-a propus lui Lloyd Smith o metodă îmbunătățită de secvențiere, în care baza fiecărui tip era colorată diferit. Această idee ar fi putut crește eficiența procesului Sanger de patru ori. La Sanger, în timpul secvențierii, în fiecare din cele patru eprubete (numărul bazelor) cu ajutorul ADN-polimerazei se formează un set unic de oligo-nucleotide de lungimi diferite, care includ secvența primarului. Ulterior, în eprubete se adăuga formamidă pentru a desface lanțurile și se realiza electroforeză într-un gel de poliacrilamidă pe patru benzi. În varianta lui Smith și Hunkapiller, didesoxinucleotizii sunt marcați cu patru coloranți diferiți și se realizează PCR într-o singură eprubetă. Apoi, în timpul electroforezei într-un gel de poliacrilamidă, un fascicul laser într-un anumit loc al gelului excită activitatea coloranților, iar detectorul stabilește ce nucleotide migrează în prezent prin gel. La început, Smith era pesimist — se temea că utilizarea unor doze extrem de mici de colorant va face ca regiunile nucleotide să fie indistincte. Cu toate acestea, fiind bine familiarizat cu tehnologiile laser, el a găsit repede o soluție, folosind coloranți fluorescenți speciali care fluorescează sub acțiunea radiației laser.
(Versiunea completă — 4,08 MB) Cu litere mici: secvența ADN-ului, decodificată folosind un secvențator automat, obținută dintr-un aparat de secvențiere automată. Fiecărui culoare îi corespunde una dintre cele patru baze.
În varianta clasică a metodei Sanger, una dintre lanțurile ADN-ului analizat acționează ca matrice pentru sinteza unui lanț complementar de către enzima ADN-polimerază, apoi secvența fragmentelor ADN este sortată în gel în funcție de dimensiune. Fiecare fragment care se integrează în ADN-ul sintetic și permite ulterior vizualizarea produselor reacției este marcat cu un colorant fluorescent, corespunzător bazei terminale (acest lucru a fost menționat pe p. 124); prin urmare, fluorescența acestui fragment va fi un identificator pentru baza respectivă. Apoi, trebuie doar să se efectueze detectarea și vizualizarea produselor reacției. Rezultatele sunt analizate cu ajutorul unui calculator și prezentate sub formă de secvență de vârfuri colorate, corespunzătoare celor patru nucleotide. Informația este apoi transmisă direct în sistemul informatic al computerului, eliminând procesul consumator de timp și adesea chinuitor de introducere a datelor, care îngreuna semnificativ secvențierea.
» Puteți găsi mai multe detalii despre carte pe
»
»
Pentru utilizatorii Habr, discount de 25% cu codul — PCR
Sursa: habr.com
