Laureatul american al Nobel pentru chimie Kary Mullis a murit în California, la vârsta de 74 de ani. Potrivit soției sale, decesul a avut loc pe 7 august. Cauza este insuficienta cardiaca si respiratorie datorata pneumoniei.
Însuși James Watson, descoperitorul moleculei de ADN, ne va povesti despre contribuția sa la biochimie și pentru care a primit Premiul Nobel.
Extras din cartea lui James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
ADN. Istoria revoluției genetice
Capitolul 7. Genomul uman. Scenariul de viață
...
Reacția în lanț a polimerazei (PCR) a fost inventată în 1983 de biochimistul Carey Mullis, care a lucrat la Cetus. Descoperirea acestei reacții a fost destul de remarcabilă. Mullis și-a amintit mai târziu: „Într-o vineri seară, în aprilie 1983, am avut o epifanie. Eram la volan, conducând pe un drum de munte întortocheat, luminat de lună, din California de Nord, țara pădurilor de sequoie.” Este impresionant că într-o asemenea situație l-a lovit inspirația. Și nu este că nordul Californiei are drumuri speciale care promovează înțelegerea; doar că prietenul lui l-a văzut odată pe Mullis mergând cu viteză nesăbuită de-a lungul unei autostrăzi înghețate și nu l-a deranjat deloc. Un prieten a spus pentru New York Times: „Mullis a avut o viziune că va muri izbindu-se de un copac sequoiau. Prin urmare, nu se teme de nimic în timp ce conduce, cu excepția cazului în care cresc arbori de sequoie de-a lungul drumului.” Prezența sequoiaselor de-a lungul drumului l-a forțat pe Mullis să se concentreze și... iată, o perspectivă. Mullis a primit Premiul Nobel pentru Chimie pentru invenția sa în 1993 și de atunci a devenit și mai ciudat în acțiunile sale. De exemplu, el este un susținător al teoriei revizioniste conform căreia SIDA nu are legătură cu HIV, care i-a subminat în mod semnificativ propria reputație și a interferat cu medicii.
PCR este o reacție destul de simplă. Pentru a-l realiza, avem nevoie de doi primeri sintetizați chimic care sunt complementari capetelor opuse ale diferitelor catene ale fragmentului de ADN necesar. Primerii sunt secțiuni scurte de ADN monocatenar, fiecare având aproximativ 20 de perechi de baze în lungime. Particularitatea primerilor este că ei corespund secțiunilor de ADN care trebuie amplificate, adică șablonul ADN.
(Imagine pe care se poate face clic) Kary Mullis, inventatorul PCR
Specificitatea PCR se bazează pe formarea de complexe complementare între matriță și primeri, oligonucleotide sintetice scurte. Fiecare primer este complementar uneia dintre catenele șablonului dublu catenar și limitează începutul și sfârșitul regiunii amplificate. De fapt, „matricea” rezultată este un întreg genom, iar scopul nostru este să izolăm fragmentele de interes pentru noi din acesta. Pentru a face acest lucru, șablonul ADN dublu catenar este încălzit la 95 °C timp de câteva minute pentru a separa catenele de ADN. Această etapă se numește denaturare deoarece legăturile de hidrogen dintre cele două catene de ADN sunt rupte. Odată ce firele s-au separat, temperatura este coborâtă pentru a permite primerilor să se lege de șablonul monocatenar. ADN polimeraza începe replicarea ADN-ului prin legarea de o întindere a lanțului nucleotidic. Enzima ADN polimeraza reproduce catena matriță folosind un primer ca primer sau exemplu pentru copiere. Ca rezultat al primului ciclu, obținem dublarea secvențială multiplă a unei anumite secțiuni de ADN. Apoi repetam aceasta procedura. După fiecare ciclu obținem o zonă țintă în cantitate dublă. După douăzeci și cinci de cicluri PCR (adică în mai puțin de două ore), avem regiunea ADN care ne interesează într-o cantitate de 225 de ori mai mare decât cea originală (adică am amplificat-o de aproximativ 34 de milioane de ori). De fapt, la intrare am primit un amestec de primeri, ADN șablon, enzimă ADN polimerază și baze libere A, C, G și T, cantitatea unui produs de reacție specific (limitat de primeri) crește exponențial, iar numărul de „ lungi” copiile ADN sunt liniare, astfel încât produsele de reacție domină.
Amplificarea secțiunii ADN dorite: reacția în lanț a polimerazei
În primele zile ale PCR, principala problemă a fost următoarea: după fiecare ciclu de încălzire-răcire, ADN polimeraza trebuia adăugată la amestecul de reacție, deoarece era inactivată la o temperatură de 95 ° C. Prin urmare, a fost necesar să-l re-adăugați înainte de fiecare dintre cele 25 de cicluri. Procedura de reacție a fost relativ ineficientă, a necesitat mult timp și enzima polimerază, iar materialul a fost foarte scump. Din fericire, Mama Natura a venit în ajutor. Multe animale se simt confortabil la temperaturi mult mai mari de 37 °C. De ce a devenit importantă pentru noi cifra 37 °C? Acest lucru s-a întâmplat deoarece această temperatură este optimă pentru E. coli, din care s-a obținut inițial enzima polimerază pentru PCR. În natură există microorganisme ale căror proteine, de-a lungul a milioane de ani de selecție naturală, au devenit mai rezistente la temperaturi ridicate. S-a propus să se utilizeze ADN polimeraze din bacterii termofile. Aceste enzime s-au dovedit a fi termostabile și au putut rezista multor cicluri de reacție. Utilizarea lor a făcut posibilă simplificarea și automatizarea PCR. Una dintre primele ADN polimeraze termostabile a fost izolată din bacteria Thermus aquaticus, care trăiește în izvoarele termale din Parcul Național Yellowstone, și a fost numită polimerază Taq.
PCR a devenit rapid calul de lucru al Proiectului Genomului Uman. În general, procesul nu este diferit de cel dezvoltat de Mullis, tocmai a fost automatizat. Nu mai eram dependenți de o mulțime de studenți absolvenți care turnau cu minuțiozitate picături de lichid în eprubete de plastic. În laboratoarele moderne care efectuează cercetări genetice moleculare, această lucrare este efectuată pe transportoare robotizate. Roboții PCR implicați într-un proiect de secvențiere la fel de mare precum genomul uman lucrează neîncetat cu volume uriașe de polimerază stabilă la căldură. Unii oameni de știință care lucrează la Proiectul Genomului Uman au fost revoltați de redevențele nerezonabil de mari adăugate la costul consumabilelor de către proprietarul brevetului PCR, gigantul farmaceutic european Hoffmann-LaRoche.
Un alt „principiu de conducere” a fost metoda de secvențiere a ADN-ului în sine. Baza chimică a acestei metode nu mai era nouă la acea vreme: Interstate Human Genome Project (HGP) a adoptat aceeași metodă ingenioasă pe care Fred Sanger o dezvoltase la mijlocul anilor 1970. Inovația constă în amploarea și gradul de automatizare pe care le-a putut atinge secvențierea.
Secvențierea automată a fost dezvoltată inițial în laboratorul lui Lee Hood de la Institutul de Tehnologie din California. A urmat liceul în Montana și a jucat fotbal la colegiu ca fundaș; Datorită lui Hood, echipa a câștigat campionatul de stat de mai multe ori. Abilitățile sale de lucru în echipă au fost utile și în cariera sa științifică. Laboratorul lui Hood era ocupat de un echipaj pestriț de chimiști, biologi și ingineri, iar laboratorul său a devenit în curând un lider în inovația tehnologică.
De fapt, metoda de secvențiere automată a fost inventată de Lloyd Smith și Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, care lucra atunci în laboratorul lui Hood, l-a abordat pe Lloyd Smith cu o propunere pentru o metodă de secvențiere îmbunătățită, în care fiecare tip de bază ar fi colorat diferit. O astfel de idee ar putea dubla de patru ori eficiența procesului Sanger. În Sanger, la secvențierea în fiecare dintre cele patru tuburi (în funcție de numărul de baze), cu participarea ADN polimerazei, se formează un set unic de oligonucleotide de lungimi diferite, inclusiv o secvență de primer. Apoi, formamidă a fost adăugată în tuburi pentru separarea lanțului și a fost efectuată electroforeza pe gel de poliacrilamidă pe patru benzi. În versiunea lui Smith și Hunkapiller, dideoxinucleotidele sunt marcate cu patru coloranți diferiți și PCR este efectuată într-un singur tub. Apoi, în timpul electroforezei pe gel de poliacrilamidă, un fascicul laser într-o locație specifică a gelului excită activitatea coloranților, iar detectorul determină ce nucleotidă migrează în prezent prin gel. La început, Smith a fost pesimist - s-a temut că utilizarea unor doze ultra-scăzute de colorant ar duce la imposibilitatea de a distinge regiunile nucleotidice. Cu toate acestea, având o înțelegere excelentă a tehnologiei laser, el a găsit curând o cale de a ieși din situație folosind coloranți speciali fluorocromi care fluoresc atunci când sunt expuși la radiații laser.
(Versiunea completa - 4,08 MB) Imprimare fină: secvență de ADN secvențiată folosind un secvențietor automat, obținută de la o mașină de secvențiere automată. Fiecare culoare corespunde uneia dintre cele patru baze
În varianta clasică a metodei Sanger, una dintre catenele ADN-ului analizat acționează ca șablon pentru sinteza unei catene complementare de către enzima ADN polimeraza, apoi secvența fragmentelor de ADN este sortată într-un gel după dimensiune. Fiecare fragment, care este inclus în ADN în timpul sintezei și permite vizualizarea ulterioară a produșilor de reacție, este marcat cu un colorant fluorescent corespunzător bazei terminale (acest lucru a fost discutat la p. 124); prin urmare, fluorescența acestui fragment va fi un identificator pentru o bază dată. Apoi, tot ce rămâne este să efectuăm detectarea și vizualizarea produselor de reacție. Rezultatele sunt analizate de computer și prezentate ca o secvență de vârfuri multicolore corespunzătoare la patru nucleotide. Informațiile sunt apoi transferate direct în sistemul informatic al computerului, eliminând procesul de introducere a datelor, consumator de timp și uneori dureros, care a făcut secvențierea foarte dificilă.
» Mai multe detalii despre carte gasiti la
»
»
Pentru Khabrozhiteley 25% reducere folosind cupon - PCR
Sursa: www.habr.com