V Kalifornii vo veku 74 rokov zomrel americký nobelovský laureát v oblasti chémie Kary Mullis. Podľa jeho manželky smrť nastala 7. augusta. Príčina — srdcová a dýchacía nedostatočnosť spôsobená pneumóniou.
O tom, aký prínos mal pre biochémiu a za čo získal Nobelovu cenu, nám povie samotný James Watson — objaviteľ molekuly DNA.
Úryvok z knihy Jamesa Watsona, Andrewa Berryho, Kevina Davisa
DNA. História genetickej revolúcie
Kapitola 7. Genóm človeka. Scenár života
…
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) bola vynájdená v roku 1983 biochémikom Kary Mullisom, ktorý pracoval v spoločnosti Cetus. Objav tejto reakcie bol veľmi pozoruhodný. Neskôr Mullis spomínal: „Raz v piatok v apríli 1983 som bol akosi osvietený. Viedol som auto, išiel po osvetlenej mesačným svetlom zvlňenej horskej ceste v Severnej Kalifornii, na okraji sekvojových lesov.” Je pôsobivé, že práve v takej situácii ho navštívila inšpirácia. A nie je to tak, že na severe Kalifornie sú špeciálne cesty, ktoré napomáhajú osvieteniu; jednoducho jeho priateľ raz videl, ako Mullis bezhlavo uháňa po zľadovatelej ceste s obojsmerným pohybom a vôbec ho to neznepokojovalo. Priateľ povedal New York Times: „Mullisovi sa zdalo, že zomrie, naraziac do sekvoje. Preto sa nebojí jazdiť, ak pozdĺž cesty nerastú sekvoje.” Prítomnosť sekvojí pozdĺž cesty donútila Mullisa sústrediť sa a… aha, osvietenie. Za svoj vynález získal v roku 1993 Mullis Nobelovu cenu za chémiu a odvtedy sa stal ešte podivnejším vo svojich činostiach. Napríklad je zástancom revizionistickej teórie, že AIDS nie je spojený s HIV, čím značne podkopal svoju vlastnú reputáciu a znepríjemnil život lekárom.
PCR je pomerne jednoduchá reakcia. Na jej vykonanie potrebujeme dva chemicky syntetizované primery, komplementárne k opačným koncom rôznych reťazcov požadovaného fragmentu DNA. Primery sú krátke úseky jednovláknovej DNA, každý s dĺžkou približne 20 párov báz. Osobitosť primerov spočíva v tom, že zodpovedajú úsekom DNA, ktoré je potrebné amplifikovať, teda DNA materskej.
(Obrázok je klikateľný) Kary Mullis, vynálezca PCR
Špecifickosť PCR je založená na tvorbe komplementárnych komplexov medzi matricou a primerami, krátkymi syntetickými oligonukleotidmi. Každý z primerov je komplementárny jednej z reťazcov dvojzávitovej matice a obmedzuje začiatok a koniec amplifikovanej oblasti. Fakticky získaná „matrika“ predstavuje celý genóm a naším cieľom je izolovať z nej fragmenty, ktoré nás zaujímajú. Na tento účel sa dvojzávitová DNA matica zahreje na 95 °C na niekoľko minút, aby sa reťazce DNA rozdelili. Táto fáza sa nazýva denaturácia, pretože sa ničia vodíkové väzby medzi dvoma reťazcami DNA. Keď sa reťazce rozdelia, teplota sa zníži, aby sa primery mohli viazať na jednoväzobnú maticu. DNA polymeráza začína replikáciu DNA, pričom sa viaže na úsek reťazca nukleotidov. Enzym DNA polymeráza replikujte maticový reťazec a používa primer ako nástroj alebo vzor na kopírovanie. Výsledkom prvého cyklu je opakované sekvenčné zdvojenie konkrétneho úseku DNA. Potom túto procedúru opakujeme. Po každom cykle získavame cieľový úsek v dvojnásobnom množstve. Po dvadsiatich piatich cykloch PCR (t.j. za menej ako dve hodiny) máme úsek DNA, ktorý nás zaujíma, v množstve 225-krát vyššom ako pôvodné (t.j. amplifikovali sme ho približne 34 miliónov krát). Fakticky sme na vstupe mali zmes primerov, materskej DNA, enzýmu DNA polymerázy a voľných báz A, C, G a T, množstvo špecifického produktu reakcie (obmedzeného primerami) rastie exponenciálne, zatiaľ čo množstvo „dlhých“ kópií DNA rastie lineárne, preto v produktoch reakcie dominuje.
Amplifikácia požadovaného úseku DNA: polymerázová reťazová reakcia
Na začiatku používania PCR bola hlavná problém v tom, že po každom cykle zahriatia a ochladenia bolo potrebné pridať do reakčnej zmesi DNA polymerázu, pretože sa inaktivovala pri teplote 95 °C. Preto bolo potrebné ju opätovne pridávať pred každým z 25 cyklov. Procedúra vykonávania reakcie bola relatívne neefektívna, vyžadovala veľa času a enzýmu polymerázy, čo nie je lacný materiál. Našťastie príroda prišla na pomoc. Mnoho zvierat sa cíti pohodlne pri teplotách, ktoré sú oveľa vyššie ako 37 °C. Prečo sa pre nás stala táto teplota dôležitou? Stalo sa to preto, že táto teplota je optimálna pre E. coli, z ktorej sa pôvodne získavala enzým polymerázy pre PCR. V prírode sa nachádzajú mikroorganizmy, ktorých proteíny sa v priebehu miliónov rokov prirodzeného výberu stali odolnejšími voči vysokým teplotám. Bolo navrhnuté používať DNA polymerázy z termofilných baktérií. Tieto enzýmy sa ukázali ako termostabilné a boli schopné zvládnuť mnoho cyklov reakcie. Ich použitie umožnilo zjednodušiť a automatizovať vykonávanie PCR. Jedna z prvých termostabilných DNA polymeráz bola izolovaná z baktérie Thermus aquaticus, ktorá žije v horúcich prameňoch Národného parku Yellowstone, a nazvala sa Taq polymerázou.
PCR sa rýchlo stala hlavnou pracovnou silou projektu "Genóm človeka". V podstate je proces rovnaký ako ten, ktorý vyvinul Mullis, len bol automatizovaný. Už sme sa nespoliehali na skupinu slepých postgraduálnych študentov, ktorí starostlivo prelievali kvapky tekutiny do plastových skúmaviek. V moderných laboratóriách, ktoré vykonávajú molekulárno-genetický výskum, sa táto práca vykonáva na robotizovaných linkách. PCR roboty zapojené do takéhoto rozsiahleho projektu sekvenovania ako "Genóm človeka" neúprosne pracujú s obrovskými objemami termostabilnej polymerázy. Niektorí vedci zapojení do projektu "Genóm človeka" boli pobúrení neodôvodnenými vysokými poplatkami, ktoré majiteľ patentu na PCR, európsky priemyselný farmaceutický gigant Hoffmann-LaRoche, pridáva k nákladom na spotrebný materiál.
Druhým "hnacím motorom" bol samotný metóda sekvenovania DNA. Chemický základ tejto metódy už vtedy nebol novinkou: Medzinárodný projekt "Genóm človeka" (HGP) prijal rovnaký vynaliezavý prístup, ktorý vyvinul Fred Sanger už v polovici 70. rokov. Inovácia spočívala v rozsahu a úrovni automatizácie, ktorých sa podarilo dosiahnuť pri sekvenovaní.
Automatické sekvenovanie sa pôvodne vyvíjalo v laboratóriu Li Huda na Kalifornskom technologickom inštitúte. Ukončil školu v štáte Montana a hral americký futbal na pozícii útočníka; vďaka Hudovi tím niekoľkokrát vyhral štátny šampionát. Zručnosti tímovej spolupráce mu pomohli aj v jeho vedeckej kariére. V Hudovom laboratóriu pracoval pestrofarebný tím chemikov, biológov a inžinierov, a čoskoro sa jeho laboratórium stalo lídrom v oblasti technologických inovácií.
Metóda automatického sekvenovania bola v skutočnosti vynájdená Lloydom Smithom a Mikeom Hunkapillerom. Mike Hunkapiller, ktorý vtedy pracoval v Hudovej laboratórii, oslovil Lloyda Smitha s návrhom na zdokonalenú metódu sekvenovania, v ktorej by boli bázy každého typu sfarbené do rôznych farieb. Takýto koncept mohol zvýšiť efektivitu Sangerovho procesu až štvornásobne. Pri sekvenovaní od Sangeru sa v každej zo štyroch skúmaviek (podľa počtu báz) za účasti DNA polymerázy vytvára jedinečný súbor oligonukleotidov rôznej dĺžky, ktorý zahŕňa primérovú sekvenciu. Následne sa do skúmaviek pridával formamid na rozpad reťazcov a vykonával sa elektroforéza v polyakrylamidovom géli na štyroch dráhach. V variante Smitha a Hunkapillera sú didenzoxynukleotidy označené štyrmi rôznymi farbivami a PCR sa vykonáva v jednej skúmavke. Potom, počas elektroforézy na polyakrylamidovom géli, lúč laseru na určenom mieste gélu aktivuje farbivá a detektor určuje, ktorý nukleotid momentálne migruje cez gél. Sprvu bol Smith pesimisticky naladený — obával sa, že použitie ultra malých dávok farbiva povedie k tomu, že nukleotidové úseky budú nezrozumiteľné. Avšak vďaka vynikajúcemu ovládaniu laserových technológií čoskoro našiel riešenie, keď použil špeciálne fluorescenčné farbivá, ktoré fluorescujú pri pôsobení laserového žiarenia.
(Úplná verzia — 4,08 MB) Malým písmom: sekvencia DNA, ktorú dekódoval automatický sekvenátor, získaná z prístroja na automatické sekvenovanie. Každej farbe zodpovedá jedna z štyroch báz.
V klasickej variante metódy Sanger sa jedna z reťazcov analyzovanej DNA používa ako matrica na syntézu komplementárneho reťazca enzýmom DNA polymerázou, potom sa sekvencia fragmentov DNA triedi v géli podľa veľkosti. Každý fragment, ktorý sa zahŕňa do DNA počas syntézy a umožňuje následne vizualizovať produkty reakcie, je označený fluorescenčným farbivom, ktoré zodpovedá terminálnej báze (o tom sa hovorilo na str. 124); preto fluorescencia tohto fragmentu bude identifikátorom pre danú bázu. Potom stačí len vykonať detekciu a vizualizovať produkty reakcie. Výsledky analyzujú pomocou počítača a prezentujú vo forme sekvencie rônofarebných špic, ktoré zodpovedajú štyrom nukleotidom. Ďalej sa informácie prenášajú priamo do informačného systému počítača, čím sa vylučuje časovo náročný a niekedy mučivý proces zadávania údajov, ktorý veľmi komplikoval sekvenovanie.
» Podrobnejšie informácie o knihe nájdete na
»
»
Pre Habr čitateľov zľava 25% s kupónom — PCR
Zdroj: habr.com
