V Kaliforniji je v 74. letu starosti umrl ameriški Nobelov nagrajenec za kemijo Kary Mullis. Po navedbah njegove žene se je smrt zgodila 7. avgusta. Vzrok je odpoved srca in dihal zaradi pljučnice.
Sam James Watson, odkritelj molekule DNK, nam bo povedal o svojem prispevku k biokemiji in za kar je prejel Nobelovo nagrado.
Odlomek iz knjige Jamesa Watsona, Andrewa Berryja, Kevina Davisa
DNK. Zgodovina genetske revolucije
Poglavje 7. Človeški genom. Življenjski scenarij
...
Verižno reakcijo s polimerazo (PCR) je leta 1983 izumil biokemik Carey Mullis, ki je delal pri Cetusu. Odkritje te reakcije je bilo izjemno. Mullis se je kasneje spominjal: »Nekega petka zvečer aprila 1983 sem imel razodetje. Sedel sem za volanom in se vozil po z mesečino obsijani, vijugasti gorski cesti v severni Kaliforniji, deželi gozdov sekvoje.” Impresivno je, da ga je ravno v takšni situaciji prevzel navdih. In ne gre za to, da ima severna Kalifornija posebne ceste, ki spodbujajo vpogled; le da je njegov prijatelj nekoč videl Mullisa, kako nepremišljeno hiti po poledenelem dvopasišču in ga to sploh ni motilo. Prijatelj je za New York Times povedal: »Mullis je imel vizijo, da bo umrl, ko bo trčil v sekvojo. Zato se med vožnjo ne boji ničesar, razen če ob cesti rastejo sekvoje.” Prisotnost sekvoj ob cesti je prisilila Mullisa, da se je osredotočil in ... tukaj je bil vpogled. Mullis je za svoj izum leta 1993 prejel Nobelovo nagrado za kemijo in od takrat je v svojih dejanjih postal še bolj čuden. Na primer, je zagovornik revizionistične teorije, da aids ni povezan z virusom HIV, kar je močno spodkopalo njegov ugled in poseglo v zdravnike.
PCR je dokaj preprosta reakcija. Za izvedbo potrebujemo dva kemično sintetizirana primerja, ki sta komplementarna nasprotnim koncem različnih verig zahtevanega fragmenta DNA. Primerji so kratki odseki enoverižne DNK, od katerih je vsak dolg približno 20 baznih parov. Posebnost primerjev je v tem, da ustrezajo odsekom DNK, ki jih je treba pomnožiti, torej predlogi DNK.
(Sliko lahko kliknete) Kary Mullis, izumitelj PCR
Specifičnost PCR temelji na tvorbi komplementarnih kompleksov med šablono in primerji, kratkimi sintetičnimi oligonukleotidi. Vsak primer je komplementaren eni od verig dvoverižne predloge in omejuje začetek in konec pomnožene regije. Pravzaprav je nastala "matrika" celoten genom in naš cilj je iz njega izolirati fragmente, ki nas zanimajo. Da bi to naredili, se predloga dvoverižne DNK nekaj minut segreva na 95 °C, da se ločijo verige DNK. Ta stopnja se imenuje denaturacija, ker se vodikove vezi med obema verigama DNK prekinejo. Ko se prameni ločijo, se temperatura zniža, da se primerji lahko vežejo na enoverižno predlogo. DNA polimeraza začne replikacijo DNA z vezavo na odsek nukleotidne verige. Encim DNA polimeraza replicira vzorčno verigo z uporabo primerja kot primerja ali primera za kopiranje. Kot rezultat prvega cikla dobimo večkratno zaporedno podvajanje določenega dela DNK. Nato ponovimo ta postopek. Po vsakem ciklu dobimo ciljno površino v dvojni količini. Po petindvajsetih ciklih PCR (torej v manj kot dveh urah) imamo regijo DNK, ki nas zanima, v količini, ki je 225-krat večja od originalne (torej, pomnožili smo jo približno 34-milijonkrat). Dejansko smo na vhodu prejeli mešanico primerjev, matrične DNA, encima DNA polimeraze in prostih baz A, C, G in T, količina specifičnega reakcijskega produkta (omejenega s primerji) eksponentno raste in število »dolgih« kopij DNK je linearen, zato v reakcijskih produktih prevladuje.
Pomnoževanje želenega odseka DNA: verižna reakcija s polimerazo
V prvih dneh PCR je bil glavni problem naslednji: po vsakem ciklu segrevanja-hlajenja je bilo treba reakcijski mešanici dodati DNA polimerazo, saj je bila inaktivirana pri temperaturi 95 °C. Zato ga je bilo potrebno pred vsakim od 25 ciklov ponovno dodati. Reakcijski postopek je bil relativno neučinkovit, zahteval je veliko časa in encima polimeraze, material pa je bil zelo drag. Na srečo je na pomoč priskočila mati narava. Mnoge živali se dobro počutijo pri temperaturah, ki so precej višje od 37 °C. Zakaj je številka 37 °C postala pomembna za nas? To se je zgodilo zato, ker je ta temperatura optimalna za E. coli, iz katere je bil prvotno pridobljen encim polimeraza za PCR. V naravi obstajajo mikroorganizmi, katerih beljakovine so v milijonih let naravne selekcije postale bolj odporne na visoke temperature. Predlagana je bila uporaba DNA polimeraz iz termofilnih bakterij. Izkazalo se je, da so ti encimi termostabilni in so lahko vzdržali številne reakcijske cikle. Njihova uporaba je omogočila poenostavitev in avtomatizacijo PCR. Ena prvih termostabilnih DNA polimeraz je bila izolirana iz bakterije Thermus aquaticus, ki živi v vročih vrelcih nacionalnega parka Yellowstone, in so jo poimenovali Taq polimeraza.
PCR je hitro postal delovni konj projekta človeškega genoma. Na splošno se postopek ne razlikuje od tistega, ki ga je razvil Mullis, le avtomatiziran je. Nismo bili več odvisni od množice maloumnih podiplomskih študentov, ki so skrbno zlivali kapljice tekočine v plastične epruvete. V sodobnih laboratorijih za molekularno genetske raziskave se to delo izvaja na robotskih transporterjih. Roboti PCR, vključeni v tako velik projekt sekvenciranja kot človeški genom, neusmiljeno delajo z ogromnimi količinami toplotno stabilne polimeraze. Nekateri znanstveniki, ki delajo na projektu človeškega genoma, so bili ogorčeni nad nerazumno visokimi licenčninami, ki jih je lastnik patenta PCR, evropski industrijski farmacevtski velikan Hoffmann-LaRoche, dodal stroškom potrošnega materiala.
Drugo "gonilo" je bila sama metoda sekvenciranja DNK. Kemična osnova te metode takrat ni bila več nova: meddržavni projekt človeškega genoma (HGP) je sprejel isto genialno metodo, ki jo je Fred Sanger razvil že sredi sedemdesetih let. Inovacija je bila v obsegu in stopnji avtomatizacije, ki ju je sekvenciranje uspelo doseči.
Avtomatizirano sekvenciranje je bilo prvotno razvito v laboratoriju Lee Hooda na Kalifornijskem tehnološkem inštitutu. Obiskoval je srednjo šolo v Montani in igral univerzitetni nogomet kot branilec; Zahvaljujoč Hoodu je ekipa več kot enkrat osvojila državno prvenstvo. Veščine timskega dela so mu prišle prav tudi v znanstveni karieri. V Hoodovem laboratoriju je delala pestra ekipa kemikov, biologov in inženirjev, njegov laboratorij pa je kmalu postal vodilni na področju tehnoloških inovacij.
Pravzaprav sta metodo avtomatiziranega zaporedja izumila Lloyd Smith in Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, ki je takrat delal v Hoodovem laboratoriju, se je obrnil na Lloyda Smitha s predlogom za izboljšano metodo zaporedja, pri kateri bi bila vsaka vrsta baze obarvana drugače. Takšna ideja bi lahko štirikrat povečala učinkovitost Sangerjevega procesa. Pri Sangerju pri sekvenciranju v vsaki od štirih epruvet (glede na število baz) s sodelovanjem DNA polimeraze nastane edinstven nabor oligonukleotidov različnih dolžin, vključno s primersko sekvenco. Nato smo v epruvete dodali formamid za ločevanje verig in na štirih stezah izvedli elektroforezo v poliakrilamidnem gelu. V različici Smitha in Hunkapillerja so dideoksinukleotidi označeni s štirimi različnimi barvili in PCR se izvaja v eni epruveti. Nato med elektroforezo v poliakrilamidnem gelu laserski žarek na določeni lokaciji na gelu vzbudi aktivnost barvil, detektor pa ugotovi, kateri nukleotid trenutno migrira skozi gel. Sprva je bil Smith pesimističen - bal se je, da bi uporaba ultra nizkih odmerkov barvila privedla do neločljivosti nukleotidnih regij. Ker pa je odlično razumel lasersko tehnologijo, je kmalu našel izhod iz situacije z uporabo posebnih fluorokromnih barvil, ki ob izpostavljenosti laserskemu sevanju fluorescirajo.
(Celotna različica - 4,08 MB) Drobni tisk: Zaporedje DNK, sekvencirano z avtomatskim sekvencerjem, pridobljeno iz avtomatskega sekvencerja. Vsaka barva ustreza eni od štirih osnov
Pri klasični različici Sangerjeve metode ena od verig analizirane DNK deluje kot matrica za sintezo komplementarne verige z encimom DNK polimeraza, nato se zaporedje fragmentov DNK v gelu razvrsti po velikosti. Vsak fragment, ki je med sintezo vključen v DNA in omogoča kasnejšo vizualizacijo reakcijskih produktov, je označen s fluorescenčnim barvilom, ki ustreza terminalni bazi (o tem smo govorili na str. 124); zato bo fluorescenca tega fragmenta identifikator za dano bazo. Potem ostane le še izvesti detekcijo in vizualizirati produkte reakcije. Rezultati so analizirani z računalnikom in predstavljeni kot zaporedje večbarvnih vrhov, ki ustrezajo štirim nukleotidom. Informacije se nato prenesejo neposredno v informacijski sistem računalnika, s čimer se odpravi zamuden in včasih boleč postopek vnašanja podatkov, ki je zelo oteževal določanje zaporedja.
» Več o knjigi najdete na
»
»
Za Khabrozhiteley 25% popust z uporabo kupona - PCR
Vir: www.habr.com