Në Kaliforni, në moshën 74 vjeçare vdiq nobelisti amerikan në kimikë Keri Malis. Sipas gruas së tij, vdekja ndodhi më 7 gusht. Arsyet ishin dështimi kardiak dhe respirator për shkak të pneumonisë.
PĂ«r kontributin e tij nĂ« biokimie dhe pĂ«r çfarĂ« mori Ămimin Nobel, do tĂ« na tregojĂ« vetĂ« Xhejms Votson â zbuluĂ«si i molekulĂ«s sĂ« ADN-sĂ«.
Një fragment nga libri i Xhejms Votsonit, Endrju Berit, Kevin Devis
ADN. Historia e revolucionit genetik
Kapitulli 7. Genomi i njeriut. Scenari i jetës
âŠ
Reaksioni i polimerazĂ«s sĂ« zinxhirit (PCR) u shpik nĂ« vitin 1983 nga biohemiku Kary Mullis, qĂ« punonte nĂ« kompaninĂ« Cetus. Zbulimi i kĂ«tij reagimi ishte mjaft i veçantĂ«. MĂ« vonĂ«, Mullis pĂ«rmendi: «NjĂ«herĂ«, njĂ« tĂ« premte nĂ« mbrĂ«mje nĂ« prill 1983, ndjeva si njĂ« ndriçim. Ishim duke vozitur nĂ« njĂ« rrugĂ« malore tĂ« ngjashme me njĂ« lak, e mbushur me dritĂ« hĂ«ne nĂ« veri tĂ« KalifornisĂ«, nĂ« kufirin e pyjeve tĂ« sekvoje». ĂshtĂ« e jashtĂ«zakonshme se si frymĂ«zimi e vizitoi atĂ« nĂ« njĂ« moment tĂ« tillĂ«. Nuk Ă«shtĂ« se rrugĂ«t nĂ« veri tĂ« KalifornisĂ« janĂ« tĂ« veçanta pĂ«r tĂ« nxitur frymĂ«zimin; thjesht, njĂ« mik i tij kishte parĂ« dikur Mullis duke u ngarendur me zell nĂ« njĂ« rrugĂ« tĂ« akullt me dy drejtime dhe kjo nuk e shqetĂ«sonte aspak. Mik i tij i tha New York Times: «Mullis pa veten se do tĂ« vdiste duke u pĂ«rplasur me njĂ« sekvoje. Prandaj, ai nuk ka frikĂ« tĂ« vozisĂ«, nĂ«se rrugĂ«s nuk i rriten sekvojat». Prania e sekvojave pĂ«rgjatĂ« rrugĂ«s e bĂ«nte Mullis tĂ« pĂ«rqendrohej dhe... ja, ndriçimi. PĂ«r shpikjen e tij, nĂ« vitin 1993, Mullis mori Ămimin Nobel pĂ«r KiminĂ« dhe qĂ« atĂ«herĂ« u bĂ« edhe mĂ« i çuditshĂ«m nĂ« veprimet e tij. PĂ«r shembull, ai Ă«shtĂ« mbĂ«shtetĂ«s i teorisĂ« revizioniste qĂ« SIDA nuk Ă«shtĂ« e lidhur me HIV-in, gjĂ« qĂ« e ka minuar ndjeshĂ«m reputacionin e tij dhe ka penguar mjekĂ«t.
PCR është një reaksion mjaft i thjeshtë. Për ta realizuar, ne na duhen dy primerë të sintetizuar kimikisht, që janë komplementarë me skajet e kundërta të zinxhirëve të ndryshëm të fragmentit të kërkuar të ADN-së. Primerët janë segmente të shkurtër të ADN-së një-nitore, secili rreth 20 baza në gjatësi. Karakteristika e primerëve është që ata përputhen me segmentet e ADN-së që duhen amplifikohen, pra me ADN-në matricë.
(Imazhi është klikues) Keri Mullis, shpikësi i PCR
Specifikoja e PCR-sĂ« bazohet nĂ« formimin e komplekseve komplementarĂ« midis matricĂ«s dhe primarĂ«ve, oligomereve sintetike tĂ« shkurtra. Ădo primar Ă«shtĂ« komplementar ndaj njĂ« prej zinxhirĂ«ve tĂ« matricĂ«s dyfish dhe pĂ«rcakton fillimin dhe mbarimin e seksionit tĂ« amplifikuar. NĂ« praktikĂ«, matrica e marrĂ« pĂ«rfaqĂ«son njĂ« genom tĂ« plotĂ«, dhe qĂ«llimi ynĂ« Ă«shtĂ« tĂ« izolojmĂ« fragmentet qĂ« na interesojnĂ«. PĂ«r kĂ«tĂ«, matrica e ADN-sĂ« dyfishe ngrohet deri nĂ« 95 °C pĂ«r disa minuta, nĂ« mĂ«nyrĂ« qĂ« zinxhirĂ«t e ADN-sĂ« tĂ« ndahen. Kjo fazĂ« quhet denaturim, pasi theren lidhjet hidrogjenore midis dy zinxhirĂ«ve tĂ« ADN-sĂ«. Pasi zinxhirĂ«t janĂ« ndarĂ«, temperatura ulet pĂ«r tĂ« lejuar qĂ« primarĂ«t tĂ« lidhĂ«n me matricĂ«n njĂ«zinxhji. Polimeraza e ADN-sĂ« fillon replikimin e ADN-sĂ«, duke u lidhur me segmentin e zinxhirit tĂ« nukleotideve. Enzima polimeraza e ADN-sĂ« replikon zinxhirin matricĂ«, duke pĂ«rdorur primarin si njĂ« pĂ«rguidhĂ«s ose shembull pĂ«r kopjim. Si rezultat i ciklit tĂ« parĂ«, arrijmĂ« njĂ« shumĂ«fishim tĂ« shumtĂ« tĂ« njĂ« seksioni tĂ« caktuar tĂ« ADN-sĂ«. MĂ« pas, e pĂ«rsĂ«risim kĂ«tĂ« procedurĂ«. Pas çdo cikli, arrijmĂ« njĂ« seksion qĂ«llimi nĂ« dyfishin e sasisĂ«. Pas njĂ«zet e pesĂ« ciklesh PCR (dmth, pĂ«r mĂ« pak se dy orĂ«), kemi seksionin tonĂ« tĂ« ADN-sĂ« nĂ« njĂ« sasi qĂ« e tejkalon origjinalen me 225 herĂ« (dmth, e kemi amplifikuar rreth 34 milion herĂ«). NĂ« fakt, nĂ« hyrje kishim njĂ« pĂ«rzierje tĂ« primarĂ«ve, matricĂ«s sĂ« ADN-sĂ«, enzimes polimeraza e ADN-sĂ« dhe bazave tĂ« lira A, C, G dhe T, sasia e produktit specifik tĂ« reaksionit (tĂ« kufizuar nga primarĂ«t) rritet eksponencialisht, ndĂ«rsa sasia e kopjeve 'tĂ« gjata' tĂ« ADN-sĂ« nĂ« mĂ«nyrĂ« lineare, prandaj nĂ« produktet e reaksionit dominon.
Amplifikimi i segmentit përkatës të ADN-së: reaksioni i zinxhirit të polimerazës
Në fillim të përdorimit të PCR, problemi kryesor ishte se pas çdo cikli ngrohjeje-ftohjeje, duheshin shtuar ADN polimeraza në përzierjen reagente, pasi ajo inaktivizohej në temperaturën 95 °C. Prandaj, ishte e nevojshme të shtohej përsëri para secilit prej 25 cikleve. Procedura e zhvillimit të reaksionit ishte relativisht e papërshkueshme, kërkonte shumë kohë dhe enzim polimeraze, dhe materiali nuk ishte aspak i lira. Fatmirësisht, natyra erdhi në ndihmë. Shumë kafshë ndihen rehat në temperatura shumë më të larta se 37 °C. Pse numri 37 °C bëri rëndësi për ne? Kjo ndodhi sepse kjo temperaturë është optimale për E. coli, nga e cila fillimisht u mor enzima polimeraze për PCR. Në natyrë gjenden mikroorganizma, proteinat e të cilëve pas miliona vitesh seleksionimi natyror u bënë më të qëndrueshme ndaj veprimit të temperaturave të larta. U propozua përdorimi i ADN polimerazave nga bakteret termofile. Këto enzima u treguan termostabile dhe ishin në gjendje të përballonin shumë cikle të reaksionit. Përdorimi i tyre mundësoi thjeshtimin dhe automatizimin e zhvillimit të PCR. Një nga polimerazat e para termostabile të ADN-së u izolua nga bakteria Thermus aquaticus, që jeton në burimet e nxehta të Parkut Kombëtar Yellowstone, dhe u quajt polimeraza Taq.
PCR është bërë shpejt kalimi kryesor i projektit "Gjeni i Njeriut". Në thelb, procesi nuk ndryshon nga ai i zhvilluar nga Mullis, vetëm se është automatizuar. Ne nuk varemi më nga një turmë studentësh të verbër, që me kujdes derdhin pikëza lëngu në gota plastike. Në laboratorët modernë, që kryejnë kërkime molekulare-gjenetike, kjo punë bëhet në linjat robotike. Robotët PCR, të angazhuar në një projekt kaq të gjerë si "Gjeni i Njeriut", punojnë pa pushim me sasi të mëdha polimerazash rezistente ndaj temperaturave. Disa shkencëtarë të angazhuar në projektin "Gjeni i Njeriut" ishin të shqetësuar nga tarifat e tepruara që përfshihen në kostot e materialeve të konsumit nga pronari i patentës për PCR, gjigandi industrial-farmaceutik evropian Hoffmann-LaRoche.
Një "nxitës tjetër" ishte metoda e sekvencimit të ADN-së. Baza kimike e kësaj metode tashmë nuk ishte një novitet: Projekti ndërkombëtar "Genomi i njeriut" (HGP) adoptoi të njëjtën metodë të sofistikuar, të zhvilluar nga Fred Sanger në mesin e viteve 1970. Noviteti qëndronte në shkallën dhe nivelin e automatizimit që arriti të arrihej gjatë sekvencimit.
Sekvencimi automatik u zhvillua fillimisht në laboratorin e Li Hudit në Institutin Teknologjik të Kalifornisë. Ai përfundoi shkollën në shtetin Montana dhe luante futboll amerikan në pozitat e sulmuesit; falë Hudit, ekipi fitoi disa herë kampionatin e shtetit. Aftësitë e tij të bashkëpunimit në skuadër iu shërbyen mirë edhe në karrierën shkencore. Në laboratorin e Hudit punonte një kompani e larmishme kimistësh, biologësh dhe inxhinierësh, dhe së shpejti laboratorit të tij i takoi roli i liderit në inovacionet teknologjike.
Metoda automatike tĂ« sekvencimit u shpik nĂ« tĂ« vĂ«rtetĂ« nga Lloyd Smith dhe Mike Hunzicker. Mike Hunzicker, i cili nĂ« atĂ« kohĂ« punonte nĂ« laboratorin e Hudave, i propozoi Lloyd Smith njĂ« metodĂ« tĂ« pĂ«rmirĂ«suar sekvencimi, ku bazat e çdo tipi do tĂ« ngjiteshin nĂ« ngjyrĂ« tĂ« ndryshme. Ky koncept mund tĂ« rrisĂ« efikasitetin e procesit Sanger deri nĂ« katĂ«r herĂ«. NĂ« metodĂ«n e Sangerit, gjatĂ« sekvencimit nĂ« çdo njĂ« nga katĂ«r tubat (nĂ« pĂ«rputhje me numrin e bazave) me pjesĂ«marrjen e polimerazĂ«s sĂ« ADN-sĂ« formohet njĂ« grup unik oligonukleotidesh me gjatĂ«si tĂ« ndryshme qĂ« pĂ«rfshin sekuencĂ«n e primerit. MĂ« pas, nĂ« tubat shtohej formamid pĂ«r tĂ« ndarĂ« zinxhirĂ«t dhe realizohej elektroforeza nĂ« njĂ« xhel poliakrilamid nĂ« katĂ«r shirita. NĂ« versionin e Smith dhe Hunzicker, didesoksinukleotidet etiketohet me katĂ«r ngjyrues tĂ« ndryshĂ«m dhe bĂ«het PCR nĂ« njĂ« tâsh. Pastaj, gjatĂ« elektroforezĂ«s nĂ« xhel poliakrilamid, rreze laseri nĂ« njĂ« vend tĂ« caktuar tĂ« xhelit aktivizon aktivitetin e ngjyruesve, dhe detektori pĂ«rcakton se cili nukleotid aktualisht po migron pĂ«rmes xhelit. Fillimisht, Smith kishte njĂ« qasje pesimiste - kishte frikĂ« se pĂ«rdorimi i dozave shumĂ« tĂ« vogla tĂ« ngjyruesve do ta bĂ«nte tĂ« padukshme pjesĂ«t nukleotidike. MegjithatĂ«, pasi kishte njohuri tĂ« shkĂ«lqyera mbi teknologjitĂ« laser, ai sĂ« shpejti gjeti njĂ« zgjidhje duke pĂ«rdorur ngjyrues fluorokromik tĂ« specializuar, tĂ« cilat fluorozojnĂ« nĂ«n veprimin e rrezatimit laser.
(Versioni e plotĂ« â 4,08 MB) Shkruar me letra tĂ« vogla: sekuenca e ADN-sĂ«, e dekoduar duke pĂ«rdorur sekvencuesin automatik, marrĂ« nga aparati pĂ«r sekvencimin automat. Ădo ngjyrĂ« korrespondon me njĂ« nga katĂ«r bazat
NĂ« variantin klasik tĂ« metodĂ«s sĂ« Sanger, njĂ« nga zinxhirĂ«t e ADN-sĂ« qĂ« analizohet shĂ«rben si model pĂ«r sintezĂ«n e njĂ« zinxhiri komplementar nga enzima ADN-polimeraza, pastaj sekvenca e fragmenteve tĂ« ADN-sĂ« renditet nĂ« xhel sipas madhĂ«sisĂ«. Ădo fragment qĂ« pĂ«rfshihet nĂ« strukturĂ«n e ADN-sĂ« gjatĂ« sintezĂ«s dhe lejon mĂ« pas vizualizimin e produkteve tĂ« reaksionit, etiketohĂ«t me njĂ« ngjyrues fluorescues, pĂ«rkatĂ«sisht bazĂ«s terminale (kjo u pĂ«rmend nĂ« fq. 124); kĂ«shtu, fluorecenca e kĂ«tij fragmenti do tĂ« jetĂ« identifikuesi pĂ«r kĂ«tĂ« bazĂ«. MĂ« pas duhet vetĂ«m tĂ« bĂ«het detektimi dhe vizualizimi i produkteve tĂ« reaksionit. Rezultatet analizohet me ndihmĂ«n e kompjuterit dhe paraqiten si njĂ« sekrecion pikash shumĂ«ngjyrĂ«she, pĂ«rkatĂ«sisht katĂ«r nucleotideve. MĂ« pas informacioni transmetohet drejtpĂ«rdrejt nĂ« sistemin informatik tĂ« kompjuterit, duke pĂ«rjashtuar procesin e ngadaltĂ« dhe shpesh herĂ« tĂ« mundimshĂ«m tĂ« fusjes sĂ« tĂ« dhĂ«nave, qĂ« ndihmonte shumĂ« nĂ« sekuencimin.
» Më shumë detaje për librin mund të gjenden në
»
»
PĂ«r pĂ«rdoruesit e Habr, zbritje 25% me kuponin â PCR
Burimi: habr.com
