Në Kaliforni, në moshën 74-vjeçare vdiq amerikanin nobelist të kimi Keri Mullis. Sipas bashkëshortes së tij, vdekja ndodhi më 7 gusht. Shkaku - dështimi kardiak dhe respirator për shkak të pneumonisë.
Rreth kontributit tĂ« tij nĂ« bio-kimie dhe arsyet pse mori Ămimin Nobel do na flasĂ« vetĂ« Xhejms Votson - zbuluesi i molekulĂ«s sĂ« ADN-sĂ«.
Një fragment nga libri i Xhejms Votsonit, Endrju Beri, Kevin Devis
ADN. Historia e revolucionit gjenetik
Kapitulli 7. Genomi i njeriut. Scenari i jetës
âŠ
Reaksioni i polimerazĂ«s sĂ« zinxhirit (PĂR) u shpik nĂ« vitin 1983 nga bio-kimik Keri Mullis, i punĂ«suar nĂ« kompaninĂ« Cetus. Zbulimi i kĂ«tij reaksioni ishte mjaft domethĂ«nĂ«s. MĂ« vonĂ«, Mullis kujtoi: «NjĂ« herĂ«, njĂ« tĂ« premte nĂ« mbrĂ«mje nĂ« prill 1983, ndjeva si tĂ« mĂ« kishte marrĂ« fryma. Ishte duke drejtuar, duke kaluar njĂ« rrugĂ« malore tĂ« mbuluar me dritĂ« hĂ«ne nĂ« veri tĂ« KalifornisĂ«, nĂ« vendin e pyjeve tĂ« sekvoja.» ĂshtĂ« impresionuese se pikĂ«risht nĂ« njĂ« situatĂ« tĂ« tillĂ« e vizitoi frymĂ«zimi. Dhe nuk ka tĂ« bĂ«jĂ« aspak me faktin se veriu i KalifornisĂ« ka rrugĂ« tĂ« veçanta qĂ« inkurajojnĂ« frymĂ«zimin; thjesht njĂ« mik i tij kishte parĂ« njĂ« herĂ« se Mullis po fluturonte pa kujdes nĂ« rrugĂ«n e akullt me dy kahĂ« dhe kjo nuk e shqetĂ«sonte aspak. Miku i tha New York Times: «Mullis kishte njĂ« vizion se do tĂ« vdiste duke u pĂ«rplasur me njĂ« sekvoinĂ«. Prandaj ai nuk ka frikĂ« nga drejtpĂ«rdrejtĂ«sia, pĂ«r aq kohĂ« sa pĂ«rgjatĂ« rrugĂ«s nuk ka sekvoja.» Prania e sekvoive pĂ«rgjatĂ« rrugĂ«s e bĂ«nte Mullis tĂ« pĂ«rqendrohej dhe... ja, frymĂ«zimi. PĂ«r shpikjen e tij nĂ« vitin 1993, Mullis fitoi Ămimin Nobel nĂ« kimi dhe qĂ« nga atĂ«herĂ« bĂ«het edhe mĂ« i çuditshĂ«m nĂ« veprimet e tij. PĂ«r shembull, ai Ă«shtĂ« njĂ« mbĂ«shtetĂ«s i teorisĂ« revizioniste qĂ« SIDA nuk Ă«shtĂ« e lidhur me HIV, çka ndihmon nĂ« dĂ«mtimin e reputacionit tĂ« tij dhe pengon mjekĂ«t.
PĂR Ă«shtĂ« njĂ« reaksion mjaft i thjeshtĂ«. PĂ«r ta realizuar atĂ«, na duhen dy primerĂ« tĂ« sintetizuar kimikisht, qĂ« janĂ« komplementarĂ« me skajet e kundĂ«rta tĂ« zinxhirĂ«ve tĂ« ndryshĂ«m tĂ« fraksionit tĂ« kĂ«rkuar tĂ« ADN-sĂ«. PrimerĂ«t janĂ« pjesĂ« tĂ« shkurtra tĂ« ADN-sĂ« njĂ«njĂ«she, secila rreth 20 çiftĂ« bazash nĂ« gjatĂ«si. Karakteristika e primerĂ«ve Ă«shtĂ« se ata pĂ«rputhen me pjesĂ«t e ADN-sĂ« qĂ« duhet tĂ« amplifikohen, dmth ADN-nĂ« matricĂ«.
(Imazhi Ă«shtĂ« i klikueshĂ«m) Keri Mullis, shpikĂ«si i PĂR
Specifiku e PCR-sĂ« bazohet nĂ« formimin e komplekseve komplementarĂ« midis matricĂ«s dhe primerĂ«ve, oligonukleotideve tĂ« shkurtĂ« sintetike. Ădo primer Ă«shtĂ« komplementar me njĂ« nga zinxhirĂ«t e matricĂ«s dyzanĂ«she dhe kufizon fillimin dhe pĂ«rfundimin e seksionit qĂ« do tĂ« amplifikohet. NĂ« fakt, 'matrica' e marrĂ« pĂ«rfaqĂ«son njĂ« genom tĂ« plotĂ«, dhe qĂ«llimi ynĂ« Ă«shtĂ« tĂ« nxjerrim pjesĂ«t qĂ« na interesojnĂ« prej saj. PĂ«r kĂ«tĂ«, matrica e ADN-sĂ« dyzanĂ«she ngrohet deri nĂ« 95 °C pĂ«r disa minuta, nĂ« mĂ«nyrĂ« qĂ« zinxhirĂ«t e ADN-sĂ« tĂ« ndahen. Ky hap quhet denaturim, pasi lidhjet hidrogjenore midis dy zinxhirĂ«ve tĂ« ADN-sĂ« prishen. Kur zinxhirĂ«t janĂ« ndarĂ«, temperatura ulet, nĂ« mĂ«nyrĂ« qĂ« primerĂ«t tĂ« mund tĂ« lidhĂ«zen me matricĂ«n njĂ«zanĂ«she. ADN-polimeraza fillon replikimin e ADN-sĂ«, duke u lidhur me njĂ« segment tĂ« zinxhirit tĂ« nucleotideve. Enzima ADN-polimeraza replikon zinxhirin matricor duke pĂ«rdorur primerin si njĂ« fillim ose shembull pĂ«r kopjim. Si rezultat i ciklit tĂ« parĂ«, marrim njĂ« shumĂ«fishim tĂ« vazhdueshĂ«m tĂ« njĂ« seksioni tĂ« caktuar tĂ« ADN-sĂ«. Pastaj e pĂ«rsĂ«risim kĂ«tĂ« procedurĂ«. Pas çdo cikli, marrim njĂ« segment qĂ«llim nĂ« njĂ« sasi dyfish. Pasi kalojmĂ« njĂ«zet e pesĂ« cikle PCR (dmth mĂ« pak se dy orĂ«), kemi seksionin e ADN-sĂ« qĂ« na intereson nĂ« njĂ« sasi qĂ« Ă«shtĂ« 225 herĂ« mĂ« e madhe se origjinali (dmth e kemi amplifikuar atĂ« rreth 34 milion herĂ«). NĂ« fakt, nĂ« hyrje kishim njĂ« pĂ«rzierje tĂ« primerĂ«ve, ADN-sĂ« matricore, enzimes ADN-polimeraza dhe bazave tĂ« lira A, C, G dhe T, sasia e produktit specifik tĂ« reaksionit (e kufizuar nga primerĂ«t) rritet nĂ« mĂ«nyrĂ« eksponenciale, ndĂ«rsa sasia e kopjeve 'tĂ« gjata' tĂ« ADN-sĂ« rritet nĂ« mĂ«nyrĂ« lineare, prandaj nĂ« produktet e reaksionit dominon.
Amplifikimi i seksionit të nevojshëm të ADN-së: reaksioni i zinxhirit polimerazë
Në fillim të përdorimit të PCR, problemi kryesor ishte ky: pas çdo cikli ngrohje-ftohjeje, duhej të shtohej përsëri ADN-polymeraza në përzierjen reaktive, sepse ajo inaktivizohej në temperaturën 95 °C. Prandaj, duhej ta rishkurtoshim atë para çdo njërit nga 25 ciklet. Procedura e zhvillimit të reaksionit ishte relativisht joefikase, kërkonte shumë kohë dhe fermentin e polymerazës, ndërsa materiali ishte mjaft i shtrenjtë. Me fat, natyra erdhi në ndihmë. Shumë kafshë ndihen rehat në temperatura shumë më të larta se 37 °C. Pse për ne është e rëndësishme numri 37 °C? Kjo ndodhi sepse kjo temperaturë është optimale për E. coli, nga e cila fillimisht u mor fermenti polymerazë për PCR. Në natyrë, ekzistojnë mikroorganizma, proteinat e të cilëve për miliona vjet seleksionimi natyror janë bërë më të forta ndaj veprimit të temperaturave të larta. U propozua të përdoren ADN-polymerazat nga bakteret termofile. Këto enzima rezultuan të ishin termostabile dhe ishin në gjendje të përballonin shumë cikle të reaksionit. Përdorimi i tyre e lehtësoi dhe automatizoi zhvillimin e PCR. Një nga ADN-polymerazat e para termostabile u izolua nga bakteria Thermus aquaticus, që jeton në burimet e nxehta të Parkut Kombëtar Yellowstone, dhe u quajt Taq-polymeraza.
PCR shpejt u bë kali punëtor kryesor i projektit "Gjenomi i Njeriut". Në thelb, procesi nuk ndryshon nga ai i zhvilluar nga Mullis, thjesht ai u automatizua. Ne nuk varej më nga turma e asistentëve të verbër, që derdhnin kujdesshëm pika lëngu në tubat plastikë. Në laboratorët moderne që kryejnë kërkime molekulare-gjenetike, kjo punë kryhet në linjat robotike. Robotët e PCR-së, që janë të angazhuar në një projekt të tillë të gjerë për sekvencimin si "Gjenomi i Njeriut", punojnë pa ndalim me sasi të mëdha të polymerazës rezistente ndaj nxehtësisë. Disa shkencëtarë të angazhuar në projektin "Gjenomi i Njeriut" ishin të shqetësuar për tarifat e tepërta që shtohen në koston e materialeve shpenzuese nga pronari i patentës për PCR, gjiganti industrial-farmaceutik evropian Hoffmann-LaRoche.
Një tjetër "nxitës" ishte vetë metoda e sekvencimit të ADN-së. Bazat kimike të kësaj metode atëherë nuk ishin më një novitet: Projekti Ndërqeveritar "Gjeni i Njeriut" (HGP) mori në përdorim të njëjtën metodë të ndërlikuar që Fred Sanger e zhvilloi në mesin e viteve 1970. Inovacioni qëndronte në shkallën dhe nivelin e automatizimit që arritën gjatë sekvencimit.
Sekvencimi automatik fillimisht u zhvillua në laboratorin e Lee Hood në Institutin e Teknologjisë të Kalifornisë. Ai kishte mbaruar shkollën në shtetin Montana dhe luante futboll amerikan si sulmues; falë Hudit, ekipi fitoi disa herë kampionatin e shtetit. Aftësitë e tij për punë në ekip i shërbyen edhe në karrierën shkencore. Në laboratorin e Hudit punonte një grup të larmishëm kimistësh, biologësh dhe inxhinierësh, dhe së shpejti laboratorit të tij i dha përparësi në inovacionet teknologjike.
Faktikisht, metoda e automatikĂ«s sĂ« sekvencimit u shpik nga Lloyd Smith dhe Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, i cili atĂ«kohĂ« punonte nĂ« laboratorin e Hoodit, i drejtoi Lloyd Smithit njĂ« propozim pĂ«r njĂ« metodĂ« tĂ« avancuar sekvencimi, ku baza e çdo tipi do tĂ« ngjyrosej nĂ« njĂ« ngjyrĂ« tĂ« veçantĂ«. Kjo ide mund tĂ« rritĂ« katĂ«rfish efikasitetin e procesit Sanger. NĂ« metodĂ«n Sanger, gjatĂ« sekvencimit nĂ« secilĂ«n nga katĂ«r tĂŒp (nĂ« numrin e bazave), me pjesĂ«marrjen e ADN-polimerazĂ«s krijohet njĂ« set unik oligonukleotidash me gjatĂ«si tĂ« ndryshme, duke pĂ«rfshirĂ« sekuencĂ«n e primerit. MĂ« pas nĂ« tĂŒp shtohet formamid pĂ«r tĂ« ndarĂ« zinxhirĂ«t dhe kryhet elektroforeza nĂ« njĂ« xhel poliakrilamid nĂ« katĂ«r korsi. NĂ« variantin e Smithit dhe Hunkapillerit, dideoksinukleotidĂ«t ngjyrosen me katĂ«r ngjyra tĂ« ndryshme dhe PCR kryhet nĂ« njĂ« tĂŒp. Pastaj, gjatĂ« elektroforezĂ«s nĂ« xhel poliakrilamid, njĂ« rreze laseri nĂ« njĂ« pikĂ« tĂ« caktuar tĂ« xhelit aktivizon aktivitetin e ngjyrave, dhe detektori pĂ«rcakton se cilin nukleotid po migradon nĂ« atĂ« moment nĂ«pĂ«r xhel. Fillimisht, Smith kishte njĂ« qasje pesimiste - kishte frikĂ« se pĂ«rdorimi i dozave tĂ« ultrat tĂ« vogla tĂ« ngjyrĂ«s do tĂ« sillte qĂ« pjesĂ«t nukleotidike tĂ« ishin tĂ« pathĂ«nshme. MegjithatĂ«, duke qenĂ« mjeshtĂ«r nĂ« teknologjitĂ« laserike, ai shpejt gjeti njĂ« zgjidhje duke pĂ«rdorur spiciale ngjyrues me fluorokromĂ« qĂ« fluorescojnĂ« nĂ«n veprimin e rrezatimit laserik.
(Versioni i plotĂ« â 4,08 MB) Me shkronja tĂ« vogla: sekuenca e ADN-sĂ«, e dekoduara duke pĂ«rdorur njĂ« sekvencues automatik, e marrĂ« nga aparati pĂ«r sekvencimin automatik. Ădo ngjyrĂ« korrespondon me njĂ« nga katĂ«r bazat.
Në variantin klasik të metodës së Sanger, një nga zinxhirët e ADN-së që po analizohet shërben si matrice për sintezën e një zinxhiri komplementar nga enzima ADN-polimeraza, pastaj sekuenca e fragmenteve të ADN-së klasifikohet në xhel sipas madhësisë. Secili fragment që përfshihet në përbërjen e ADN-së gjatë sintezës dhe që lejon më pas vizualizimin e produkteve të reaksionit, tregohet me një bojë fluorescente që përputhet me bazën terminale (kjo u përmend në fq. 124); për rrjedhojë, fluorescenca e këtij fragmenti do të jetë identifikuesi për këtë bazë. Më pas, mbetet vetëm të bëhet detektimi dhe vizualizimi i produkteve të reaksionit. Rezultatet analizohen me ndihmën e një kompjuteri dhe paraqiten si një sekuencë majiko-ngjyrash, që përputhen me katër nukeotidet. Informacioni përshkruhet drejtpërdrejt në sistemin informatik të kompjuterit, gjë që përjashton një proces të shpenzueshëm në kohë dhe ndonjëherë të mundimshëm të hyrjes së të dhënave, që vështirësonte shumë sekvencionimin.
» Më shumë informacion mbi librin mund të gjendet në
»
»
PĂ«r anĂ«tarĂ«t e Habra ka njĂ« zbritje prej 25% me kodin â PCR
Burimi: habr.com
