Vdiq në Kaliforni në moshën 74-vjeçare, laureati amerikan i Nobelit në kimi, Kary Mullis. Sipas bashkëshortes së tij, vdekja ka ndodhur më 7 gusht. Shkaku është dështimi i zemrës dhe i frymëmarrjes për shkak të pneumonisë.
Vetë James Watson, zbuluesi i molekulës së ADN-së, do të na tregojë për kontributin që dha në biokimi dhe për të cilin mori çmimin Nobel.
Fragment nga libri i James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
ADN-ja. Historia e Revolucionit Gjenetik
Kapitulli 7. Gjenomi i njeriut. Skenari i jetës
...
Reaksioni zinxhir i polimerazës (PCR) u shpik në 1983 nga biokimisti Carey Mullis, i cili punonte në Cetus. Zbulimi i këtij reagimi ishte mjaft i jashtëzakonshëm. Mullis më vonë kujtoi: «Një të premte në mbrëmje në prill 1983, pata një epifani. Unë isha pas timonit, duke vozitur në një rrugë malore me dritë hëne, gjarpëruese në Kaliforninë Veriore, në vendin e pyjeve të kuqtë”. Është mbresëlënëse që ishte në një situatë të tillë që e goditi frymëzimi. Dhe nuk është se Kalifornia veriore ka rrugë të veçanta që promovojnë njohuri; vetëm se shoku i tij një herë e pa Mullisin duke ecur me shpejtësi të pamatur përgjatë një karrexhate të dyfishtë të akullt dhe kjo nuk e shqetësoi aspak. Një mik i tha New York Times: “Mullis kishte një vizion se do të vdiste duke u përplasur me një pemë të kuqe. Prandaj, ai nuk ka frikë nga asgjë gjatë vozitjes, përveç nëse ka pemë të kuqe që rriten përgjatë rrugës. Prania e drurëve të kuq përgjatë rrugës e detyroi Mullisin të përqendrohej dhe... ja ku ishte, një pasqyrë. Mullis mori çmimin Nobel në Kimi për shpikjen e tij në 1993 dhe që atëherë është bërë edhe më i çuditshëm në veprimet e tij. Për shembull, ai është një mbështetës i teorisë revizioniste se SIDA nuk është e lidhur me HIV-in, gjë që minoi ndjeshëm reputacionin e tij dhe ndërhyri te mjekët.
PCR është një reagim mjaft i thjeshtë. Për ta realizuar atë, na duhen dy abetare të sintetizuara kimikisht që janë plotësuese me skajet e kundërta të vargjeve të ndryshme të fragmentit të kërkuar të ADN-së. Primerët janë seksione të shkurtra të ADN-së me një zinxhir, secila prej rreth 20 çifte bazash në gjatësi. E veçanta e abetareve është se ato korrespondojnë me seksionet e ADN-së që duhet të përforcohen, domethënë shabllonin e ADN-së.
(Imazhi i klikueshëm) Kary Mullis, shpikësi i PCR
Specifikimi i PCR bazohet në formimin e komplekseve plotësuese midis shabllonit dhe primerëve, oligonukleotideve të shkurtra sintetike. Secili prej abetareve është plotësues i njërës prej fijeve të shabllonit me dy fije dhe kufizon fillimin dhe fundin e rajonit të përforcuar. Në fakt, "matrica" që rezulton është një gjenom i tërë dhe qëllimi ynë është të izolojmë fragmentet me interes për ne prej saj. Për ta bërë këtë, shablloni i ADN-së me dy fije nxehet në 95 °C për disa minuta për të ndarë fijet e ADN-së. Kjo fazë quhet denatyrim sepse lidhjet hidrogjenore midis dy vargjeve të ADN-së janë thyer. Pasi fillesat të jenë ndarë, temperatura ulet për të lejuar abetaret të lidhen me shabllonin me një fije. ADN polimeraza fillon replikimin e ADN-së duke u lidhur me një shtrirje të zinxhirit nukleotid. Enzima ADN polimeraza përsërit vargun e shabllonit duke përdorur një abetare si një primer ose shembull për kopjim. Si rezultat i ciklit të parë, marrim dyfishim të shumëfishtë sekuencial të një seksioni të caktuar të ADN-së. Më pas e përsërisim këtë procedurë. Pas çdo cikli ne marrim një zonë të synuar në sasi të dyfishtë. Pas njëzet e pesë cikleve PCR (d.m.th., në më pak se dy orë), ne kemi rajonin e ADN-së me interes për ne në një sasi 225 herë më të lartë se origjinali (d.m.th., ne e kemi përforcuar atë afërsisht 34 milion herë). Në fakt, në hyrje morëm një përzierje të abetareve, ADN-së shabllon, enzimës së polimerazës së ADN-së dhe bazave të lira A, C, G dhe T, sasia e një produkti të veçantë reaksioni (i kufizuar nga abetaret) rritet në mënyrë eksponenciale dhe numri e kopjeve “të gjata” të ADN-së është lineare, kështu që në reaksion dominojnë produktet.
Amplifikimi i seksionit të dëshiruar të ADN-së: reaksioni zinxhir i polimerazës
Në ditët e para të PCR, problemi kryesor ishte si vijon: pas çdo cikli ngrohje-ftohje, ADN polimeraza duhej të shtohej në përzierjen e reaksionit, pasi ajo çaktivizohej në një temperaturë prej 95 ° C. Prandaj, ishte e nevojshme të ri-shtohej para secilit prej 25 cikleve. Procedura e reagimit ishte relativisht joefikase, kërkonte shumë kohë dhe enzimën polimerazë dhe materiali ishte shumë i shtrenjtë. Për fat të mirë, Nënë Natyra erdhi në shpëtim. Shumë kafshë ndihen rehat në temperatura shumë më të larta se 37 °C. Pse shifra 37 °C u bë e rëndësishme për ne? Kjo ndodhi sepse kjo temperaturë është optimale për E. coli, nga e cila fillimisht është marrë enzima polimerazë për PCR. Në natyrë ka mikroorganizma, proteinat e të cilëve, gjatë miliona viteve të përzgjedhjes natyrore, janë bërë më rezistente ndaj temperaturave të larta. Është propozuar që të përdoren polimerazat e ADN-së nga bakteret termofile. Këto enzima rezultuan të jenë të qëndrueshme termike dhe ishin në gjendje të përballonin shumë cikle reagimi. Përdorimi i tyre bëri të mundur thjeshtimin dhe automatizimin e PCR. Një nga polimerazat e para të ADN-së të qëndrueshme termike u izolua nga bakteri Thermus aquaticus, i cili jeton në burimet e nxehta të Parkut Kombëtar Yellowstone, dhe u emërua polimeraza Taq.
PCR shpejt u bë shtylla e Projektit të Gjenomit Njerëzor. Në përgjithësi, procesi nuk është i ndryshëm nga ai i zhvilluar nga Mullis, ai sapo është automatizuar. Ne nuk vareshim më nga një turmë studentësh të diplomuar me mendje të zbehtë që derdhnin me kujdes pikat e lëngut në epruveta plastike. Në laboratorët modernë që kryejnë kërkime gjenetike molekulare, kjo punë kryhet në transportues robotikë. Robotët PCR të përfshirë në një projekt sekuencimi aq të madh sa Gjenomi Njerëzor punojnë pa pushim me vëllime të mëdha polimeraze të qëndrueshme ndaj nxehtësisë. Disa shkencëtarë që punojnë në Projektin e Gjenomit Njerëzor u zemëruan nga honoraret e paarsyeshme të larta të shtuara në koston e materialeve harxhuese nga pronari i patentës PCR, gjigandi farmaceutik industrial evropian Hoffmann-LaRoche.
Një tjetër "parim drejtues" ishte vetë metoda e sekuencës së ADN-së. Baza kimike e kësaj metode nuk ishte më e re në atë kohë: Projekti Ndërshtetëror i Gjenomit Njerëzor (HGP) miratoi të njëjtën metodë të zgjuar që Fred Sanger kishte zhvilluar në mesin e viteve 1970. Risia qëndronte në shkallën dhe shkallën e automatizimit që renditja ishte në gjendje të arrinte.
Sekuenca e automatizuar u zhvillua fillimisht në laboratorin e Lee Hood në Institutin e Teknologjisë në Kaliforni. Ai ndoqi shkollën e mesme në Montana dhe luajti futboll në kolegj si qendërmbrojtës; Falë Hood, skuadra fitoi kampionatin shtetëror më shumë se një herë. Aftësitë e tij të punës në grup erdhën në ndihmë edhe në karrierën e tij shkencore. Laboratori i Hood-it kishte një ekip të larmishëm kimistësh, biologësh dhe inxhinierësh dhe laboratori i tij shpejt u bë lider në inovacionin teknologjik.
Në fakt, metoda e automatizuar e renditjes u shpik nga Lloyd Smith dhe Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, atëherë duke punuar në laboratorin e Hood-it, iu afrua Lloyd Smith me një propozim për një metodë të përmirësuar të renditjes në të cilën çdo lloj bazë do të ngjyroset ndryshe. Një ide e tillë mund të katërfishojë efikasitetin e procesit Sanger. Në Sanger, kur renditet në secilin nga katër tubat (sipas numrit të bazave), me pjesëmarrjen e polimerazës së ADN-së, formohet një grup unik i oligonukleotideve me gjatësi të ndryshme, duke përfshirë një sekuencë primer. Më pas, formamidi u shtua në tuba për ndarjen e zinxhirit dhe elektroforeza e xhelit të poliakrilamidit u krye në katër korsi. Në versionin e Smith dhe Hunkapiller, dideoksinukleotidet janë etiketuar me katër ngjyra të ndryshme dhe PCR kryhet në një tub. Më pas, gjatë elektroforezës së xhelit të poliakrilamidit, një rreze lazer në një vend specifik në xhel ngacmon aktivitetin e ngjyrave dhe detektori përcakton se cili nukleotid po migron aktualisht nëpër xhel. Në fillim, Smith ishte pesimist - ai kishte frikë se përdorimi i dozave ultra të ulëta të bojës do të bënte që rajonet nukleotide të ishin të padallueshme. Megjithatë, duke pasur një kuptim të shkëlqyeshëm të teknologjisë lazer, ai shpejt gjeti një rrugëdalje nga situata duke përdorur ngjyra të veçanta fluorokrom që fluoreshenojnë kur ekspozohen ndaj rrezatimit lazer.
(Versioni i plotë - 4,08 MB) Shkrim i imët: sekuenca e ADN-së e renditur duke përdorur një sekuencues automatik, e marrë nga një makinë renditjeje automatike. Çdo ngjyrë korrespondon me një nga katër bazat
Në versionin klasik të metodës Sanger, një nga fijet e ADN-së së analizuar vepron si një shabllon për sintezën e një vargu plotësues nga enzima ADN polimeraza, pastaj sekuenca e fragmenteve të ADN-së renditet në një xhel sipas madhësisë. Çdo fragment që përfshihet në ADN gjatë sintezës dhe lejon vizualizimin e mëvonshëm të produkteve të reaksionit është etiketuar me një ngjyrë fluoreshente që korrespondon me bazën terminale (kjo u diskutua në f. 124); prandaj, fluoreshenca e këtij fragmenti do të jetë një identifikues për një bazë të caktuar. Pastaj gjithçka që mbetet është të kryhet zbulimi dhe vizualizimi i produkteve të reagimit. Rezultatet analizohen me kompjuter dhe paraqiten si një sekuencë majash me shumë ngjyra që korrespondojnë me katër nukleotide. Informacioni më pas transferohet drejtpërdrejt në sistemin e informacionit të kompjuterit, duke eliminuar procesin e futjes së të dhënave që kërkon shumë kohë dhe ndonjëherë i dhimbshëm që e bënte shumë të vështirë renditjen.
» Më shumë detaje rreth librit mund të gjenden në
»
»
Për Khabrozhiteley 25% zbritje duke përdorur kupon - PCR
Burimi: www.habr.com