Pamenang Nobel Kimia Amérika Kary Mullis maot di California dina yuswa 74 taun. Numutkeun pamajikanana, maot lumangsung dina 7 Agustus. Anu ngabalukarkeun gagalna jantung sareng engapan kusabab pneumonia.
James Watson nyalira, anu mendakan molekul DNA, bakal nyarioskeun ka urang ngeunaan kontribusina pikeun biokimia sareng anu anjeunna nampi Hadiah Nobel.
Dicutat tina buku ku James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Sajarah Revolusi Genetik
Bab 7. Génom manusa. Skenario hirup
...
Réaksi ranté polimérase (PCR) diciptakeun dina 1983 ku ahli biokimia Carey Mullis, anu damel di Cetus. Kapanggihna réaksi ieu rada luar biasa. Mullis teras émut: "Hiji malem Jumaah dina April 1983, kuring ngagaduhan epiphany. Kuring aya di tukangeun setir, nyopir ka jalan gunung anu cahayana bulan, berliku di California Kalér, tanah leuweung redwood. Éta impressive yén éta dina kaayaan kitu nu inspirasi struck anjeunna. Na teu yén California kalér boga jalan husus nu ngamajukeun wawasan; Ngan baturna sakali ningali Mullis ngebut gagabah sapanjang jalan duaan anu tiris sareng éta henteu ngaganggu anjeunna pisan. Babaturan nyarios ka New York Times: "Mullis ngagaduhan visi yén anjeunna bakal maot ku nabrak tangkal redwood. Ku alatan éta, manéhna teu sieun nanaon bari nyetir, iwal aya tangkal redwood tumuwuh sapanjang jalan. Ayana redwoods sapanjang jalan kapaksa Mullis konsentrasi sarta ... di dieu éta, hiji wawasan. Mullis nampi Hadiah Nobel Kimia pikeun penemuanna di 1993 sareng ti saprak éta janten langkung asing dina lampahna. Salaku conto, anjeunna mangrupikeun pendukung téori révisionis yén AIDS henteu aya hubunganana sareng HIV, anu sacara signifikan ngarusak reputasi dirina sareng ngaganggu dokter.
PCR mangrupikeun réaksi anu saderhana. Pikeun ngalaksanakeunana, urang peryogi dua primer anu disintésis sacara kimia anu ngalengkepan tungtung sabalikna tina untaian anu béda tina sempalan DNA anu diperyogikeun. Primer nyaéta bagian pondok tina DNA untai tunggal, masing-masing kira-kira 20 pasangan basa panjangna. The peculiarity of primers nyaeta aranjeunna pakait jeung bagian DNA nu kudu diamplified, nyaeta, template DNA.
(Gambar tiasa diklik) Kary Mullis, panemu PCR
Spésifisitas PCR dumasar kana formasi kompléx komplementer antara citakan jeung primers, oligonukleotida sintétik pondok. Unggal primer pelengkap kana salah sahiji untaian tina citakan ganda-stranded sarta ngawatesan awal jeung tungtung wewengkon amplified. Nyatana, "matriks" anu dihasilkeun mangrupikeun génom sadayana, sareng tujuan urang nyaéta ngasingkeun fragmen anu dipikaresep ku urang ti dinya. Jang ngalampahkeun ieu, témplat DNA untaian ganda dipanaskeun nepi ka 95 °C salila sababaraha menit pikeun misahkeun untaian DNA. Tahap ieu disebut denaturasi sabab beungkeut hidrogén antara dua untaian DNA pegat. Sakali untaian geus dipisahkeun, suhu ieu lowered pikeun ngidinan primers ngabeungkeut template single-stranded. DNA polimérase ngamimitian réplikasi DNA ku cara ngabeungkeut ranté nukléotida. Énzim DNA polimérase ngaréplikasi untaian citakan maké primer minangka primer atawa conto pikeun nyalin. Salaku hasil tina siklus kahiji, urang ménta sababaraha kali ganda sequential tina bagian DNA tangtu. Salajengna urang ngulang prosedur ieu. Sanggeus unggal siklus urang ménta aréa target dina kuantitas ganda. Saatos dua puluh lima siklus PCR (nyaéta, dina waktu kurang ti dua jam), urang boga wewengkon DNA dipikaresep ku urang dina jumlah 225 kali leuwih luhur ti aslina (nyaéta, urang geus amplified eta kurang leuwih 34 juta kali). Nyatana, dina input kami nampi campuran primer, DNA template, énzim DNA polimérase sareng basa bébas A, C, G sareng T, jumlah produk réaksi khusus (diwatesan ku primer) tumbuh sacara éksponénsial, sareng jumlah " panjang" salinan DNA linier, jadi produk réaksi mendominasi.
Amplifikasi bagian DNA anu dipikahoyong: réaksi ranté polimérase
Dina dinten awal PCR, masalah utama nyaéta kieu: saatos unggal siklus pemanasan-cooling, DNA polimérase kedah ditambah kana campuran réaksi, sabab éta dinonaktipkeun dina suhu 95 ° C. Ku alatan éta, perlu pikeun nambahkeun deui saméméh unggal 25 siklus. Prosedur réaksi éta kawilang teu efisien, merlukeun loba waktu jeung énzim polimérase, sarta bahan éta pisan mahal. Kabeneran, Ibu Alam datang pikeun nyalametkeun. Loba sasatoan ngarasa nyaman dina suhu leuwih luhur batan 37 °C. Naha angka 37 °C janten penting pikeun urang? Ieu lumangsung alatan suhu ieu optimal pikeun E. coli, ti mana énzim polimérase pikeun PCR asalna diala. Di alam aya mikroorganisme anu protéinna, salami jutaan taun seléksi alam, janten langkung tahan kana suhu anu luhur. Geus diusulkeun ngagunakeun polimérase DNA tina baktéri thermophilic. Énzim ieu tétéla janten thermostable sareng tiasa tahan seueur siklus réaksi. Pamakéanna ngamungkinkeun pikeun nyederhanakeun sareng ngajadikeun otomatis PCR. Salah sahiji polymerase DNA thermostable munggaran diisolasi tina baktéri Thermus aquaticus, nu hirup di cinyusu panas Yellowstone Taman Nasional, sarta dingaranan Taq polymerase.
PCR gancang janten workhorse tina Human Genome Project. Sacara umum, prosésna henteu béda ti anu dikembangkeun ku Mullis, éta ngan ukur otomatis. Kami henteu deui gumantung kana riungan mahasiswa pascasarjana taram-witted painstakingly tuang ogé titik-titik cair kana tabung uji plastik. Di laboratorium modern anu ngalaksanakeun panalungtikan genetik molekular, padamelan ieu dilakukeun dina conveyors robotic. Robot PCR aub dina proyék sequencing saageung Génom Manusa jalan relentlessly kalawan volume badag polimér panas-stabil. Sababaraha élmuwan anu damel dina Proyék Génom Manusa ambek ku royalti anu teu munasabah luhurna ditambah kana biaya bahan bakar ku nu gaduh patén PCR, raksasa farmasi industri Éropa Hoffmann-LaRoche.
"Prinsip nyetir" anu sanés nyaéta metode pangurutan DNA sorangan. Dasar kimiawi metoda ieu geus euweuh anyar dina waktu éta: Interstate Human Genome Project (HGP) diadopsi metoda akalna sarua yén Fred Sanger geus dimekarkeun deui dina pertengahan 1970-an. Inovasi aya dina skala sareng darajat otomatisasi anu tiasa dihontal ku urutan.
Sequencing otomatis mimitina dikembangkeun di laboratorium Lee Hood di California Institute of Technology. Anjeunna dihadiran SMA di Montana sarta maén bal kuliah salaku gelandang a; Hatur nuhun kana Hood, tim meunang kajawaraan nagara leuwih ti sakali. Kaahlian gawé babarengan ogé mangpaat dina karir ilmiahna. Laboratorium Hood didamel ku awak kimiawan, biologi, sareng insinyur, sareng laboratoriumna enggal janten pamimpin inovasi téknologi.
Kanyataanna, metoda sequencing otomatis ieu invented by Lloyd Smith jeung Mike Hunapilller. Mike Hunkapiller, teras damel di laboratorium Hood, ngadeukeutkeun ka Lloyd Smith kalayan usul pikeun metode pangurutan anu langkung saé dimana unggal jinis dasarna bakal diwarnaan béda. Gagasan sapertos kitu tiasa quadruple efisiensi prosés Sanger. Dina Sanger, nalika sequencing dina unggal opat tabung (nurutkeun jumlah basa), kalawan partisipasi DNA polymerase, hiji set unik tina oligonucleotides tina panjangna béda kabentuk, kaasup runtuyan primér. Salajengna, formamide ditambahkeun kana tabung pikeun separation ranté sarta éléktroforésis gél polyacrylamide dipigawé dina opat jalur. Dina versi Smith jeung Hunkapiller, dideoxynucleotides dilabélan ku opat dyes béda jeung PCR dipigawé dina hiji tube. Saterusna, salila éléktroforésis gél polyacrylamide, sinar laser di lokasi husus dina gél ngagumbirakeun aktivitas dyes, sarta detektor nangtukeun nukléotida nu ayeuna migrasi ngaliwatan gél. Mimitina, Smith pesimis - anjeunna sieun yén ngagunakeun dosis ultra-rendah ngalelep bakal nyababkeun daérah nukléotida teu tiasa dibédakeun. Sanajan kitu, ngabogaan hiji pamahaman alus teuing tina téhnologi laser, anjeunna geura-giru manggihan jalan kaluar tina situasi ku ngagunakeun dyes fluorochrome husus nu fluoresce nalika kakeunaan radiasi laser.
(Vérsi lengkep - 4,08 MB) Fine print: runtuyan DNA sequenced maké sequencer otomatis, dicandak ti mesin sequencing otomatis. Unggal warna pakait jeung salah sahiji opat basa
Dina vérsi klasik tina metode Sanger, salah sahiji untaian DNA anu dianalisis bertindak salaku citakan pikeun sintésis untaian pelengkap ku énzim DNA polimérase, teras sekuen fragmén DNA diurutkeun dina ukuran gél. Unggal sempalan, nu kaasup dina DNA salila sintésis tur ngamungkinkeun visualisasi saterusna produk réaksi, dilabélan ku ngalelep fluoresensi pakait jeung basa terminal (ieu dibahas dina p. 124); kituna, fluoresensi sempalan ieu bakal identifier pikeun basa dibikeun. Lajeng sadayana anu tetep nyaéta pikeun ngalakukeun deteksi sareng visualisasi produk réaksi. Hasilna dianalisis ku komputer tur dibere salaku runtuyan puncak multi-warna pakait jeung opat nukléotida. Inpormasi teras dialihkeun langsung ka sistem inpormasi komputer, ngaleungitkeun prosés éntri data anu nyéépkeun waktos sareng kadang nyeri anu ngajantenkeun sekuen hésé pisan.
» Rincian langkung seueur ngeunaan buku tiasa dipendakan di
»
»
Pikeun Khabrozhiteley diskon 25% ngagunakeun kupon - PCR
sumber: www.habr.com