I Kalifornien avled den amerikanske Nobelpristagaren i kemi, Carey Mullis, vid 74 Ärs Älder. Enligt hans hustru intrÀffade dödsfallet den 7 augusti. Orsaken var hjÀrt- och andningssvikt till följd av lunginflammation.
Om vilken betydelse han hade för biokemin och varför han fick Nobelpriset, fÄr vi veta av James Watson sjÀlv - upptÀckaren av DNA-molekylen.
Utdrag ur boken av James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Historien om den genetiska revolutionen
Kapitel 7. MĂ€nniskans genom. Livets scenario
âŠ
Polymeraskedjereaktionen (PCR) uppfanns 1983 av biokemisten Carey Mullis, som arbetade pÄ företaget Cetus. UpptÀckten av denna reaktion var ganska anmÀrkningsvÀrd. Senare minns Mullis: "En fredagkvÀll i april 1983 kÀnde jag mig som om jag blev upplyst. Jag körde pÄ en mÄnbelyst slingrig bergsvÀg i Norra Kalifornien, vid grÀnsen till sekvojaskogarna." Det Àr imponerande att inspirationen kom i en sÄdan situation. Det handlar inte heller om att de norra kaliforniska vÀgarna Àr sÀrskilt speciella för att stimulera insikt; det var bara sÄ att hans vÀn en gÄng sÄg Mullis köra galet pÄ en isig vÀg med bÄda körriktningar och att det inte pÄverkade honom det minsta. VÀnnen berÀttade för New York Times: "Mullis förestÀllde sig att han skulle dö i en krock med en sekvoja. DÀrför Àr han inte rÀdd nÀr han kör, sÄ lÀnge det inte vÀxer sekvojor lÀngs vÀgen." NÀr sekvojorna var nÀrvarande lÀngs vÀgen fick Mullis att fokusera och... dÀr kom upplysningen. För sin upptÀckte fick Mullis Nobelpriset i kemi 1993 och blev sedan Ànnu mer excentrisk i sina handlingar. Till exempel stödjer han en revisionistisk teori om att AIDS inte Àr kopplat till HIV, vilket pÄtagligt skadade hans egen rykte och hindrade lÀkare.
PCR Àr en ganska enkel reaktion. För att utföra den krÀvs tvÄ kemiskt syntetiserade primers, komplementÀra till motsatta Àndar av olika kedjor av den önskade DNA-fragmentet. Primers Àr korta segment av enkelstrÀngat DNA, varje cirka 20 baspar lÄng. Egenskapen hos primers Àr att de matchar de DNA-segment som behöver amplificeras, det vill sÀga DNA-mallen.
(Bild som kan klickas) Carey Mullis, uppfinnare av PCR
Specificiteten för PCR baseras pÄ bildandet av komplementÀra komplex mellan matris och primers, korta syntetiska oligonukleotider. Varje primer Àr komplementÀr till en av strÀngarna i den dubbelstrÀngade matrisen och begrÀnsar början och slutet pÄ det amplifierade omrÄdet. Den resulterande "matrisen" representerar en hel genom, och vÄrt mÄl Àr att extrahera de fragment vi Àr intresserade av. För detta vÀrms den dubbelstrÀngade DNA-matrisen upp till 95 °C i flera minuter för att DNA-strÀngarna ska separeras. Denna fas kallas denaturering, eftersom vÀtebindningarna mellan de tvÄ DNA-strÀngarna bryts. NÀr strÀngarna har separerats sÀnks temperaturen sÄ att primrarna kan binda till den enkelstrÀngade matrisen. DNA-polymeras börjar DNA-replikationen genom att binda till en sektion av nukleotidkedjan. Enzymet DNA-polymeras replikerar matrisstrÀngen, dÀr primern anvÀnds som en startpunkt eller mall för kopiering. Som resultat av den första cykeln fÄr vi upprepade sekventiella dubblingar av ett specifikt DNA-omrÄde. Vi upprepar sedan denna procedur. Efter varje cykel fÄr vi mÄlet i dubbelt antal. Efter tjugofem PCR-cykler (det vill sÀga pÄ mindre Àn tvÄ timmar) har vi det DNA-omrÄde vi Àr intresserade av i en mÀngd som överstiger den ursprungliga med 225 gÄnger (det vill sÀga vi har amplifierat det ungefÀr 34 miljoner gÄnger). Faktiskt började vi med en blandning av primrar, matris-DNA, enzymet DNA-polymeras och fristÄende baserna A, C, G och T, dÀr mÀngden av den specifika reaktionsprodukten (begrÀnsad av primrarna) vÀxer exponentiellt, medan mÀngden "lÄnga" DNA-kopior vÀxer linjÀrt, vilket gör att reaktionsprodukten dominerar.
Amplifiering av önskat DNA-omrÄde: polymeraskedjereaktion
Vid starten av PCR-anvÀndningen var huvudproblemet följande: efter varje cykel av uppvÀrmning och nedkylning var vi tvungna att tillsÀtta DNA-polymeras till reaktionsblandningen, eftersom det inaktiverades vid 95 °C. DÀrför var det nödvÀndigt att Äter tillsÀtta det före varje av de 25 cyklerna. Proceduren för att utföra reaktionen var relativt ineffektiv, krÀvde mycket tid och polymerasenzymet var ganska dyrt. Som tur var kom moder natur till hjÀlp. MÄnga djur trivs vid temperaturer som Àr betydligt högre Àn 37 °C. Men varför blev siffran 37 °C viktig för oss? Det berodde pÄ att denna temperatur Àr optimal för E. coli, frÄn vilken enzymet polymeras ursprungligen hÀmtades för PCR. I naturen finns det mikroorganismer vars proteiner under miljontals Är av naturligt urval blivit mer motstÄndskraftiga mot höga temperaturer. Det föreslogs att anvÀnda DNA-polymeraser frÄn termofila bakterier. Dessa enzymer visade sig vara termostabila och kunde klara av mÄnga reaktionscykler. Deras anvÀndning möjliggjorde en enkel och automatiserad PCR-process. En av de första termostabila DNA-polymeraserna isolerades frÄn bakterien Thermus aquaticus, som lever i varma kÀllor i Yellowstone nationalpark, och namngavs Taq-polymeras.
PCR förvandlades snabbt till den huvudsakliga arbetskraften i projektet "HUMAN-genomet". I princip skiljer sig processen inte frÄn den som utvecklades av Mullis, bara att den automatiserades. Vi var inte lÀngre beroende av en folkmassa av halvseende doktorander som noggrant hÀvde droppar i plastprovrör. I moderna laboratorier som utför molekylÀrgenetiska studier utförs detta arbete pÄ robotiserade transportband. PCR-robotar som Àr engagerade i ett sÄ omfattande projekt för sekvensering som "HUMAN-genomet" arbetar obevekligt med stora volymer av vÀrmetÄlig polymeras. Vissa forskare som arbetar i projektet "HUMAN-genomet" blev upprörda över de orimligt höga avgifterna som patentinnehavaren av PCR, den europeiska industrilÀkemedelsjÀtten Hoffmann-LaRoche, lÀgger pÄ kostnaden för material.
En annan "drivkraft" var sjÀlva metoden för DNA-sekvensering. Den kemiska grunden för denna metod var vid den tiden redan kÀnd: Det mellanstatliga projektet "MÀnniskans genom" (HGP) anvÀnde samma smarta metod som Fred Sanger utvecklade i mitten av 1970-talet. Innovationen lÄg i skalan och graden av automatisering som uppnÄddes vid sekvenseringen.
Automatisk sekvensering utvecklades ursprungligen i Lee Hudes laboratorium vid Caltech. Han avslutade skolan i Montana och spelade amerikansk fotboll som anfallare; tack vare Hud led laget flera gÄnger till mÀsterskapet i delstaten. Hans fÀrdigheter i lagarbete kom ocksÄ till nytta i hans vetenskapliga karriÀr. I Hudes laboratorium arbetade en brokig skara kemister, biologer och ingenjörer, och snart blev hans laboratorium en ledande aktör inom teknologiska innovationer.
Metoden för automatisk sekvensering uppfanns faktiskt av Lloyd Smith och Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, som dĂ„ arbetade pĂ„ Hoods laboratorium, kontaktade Lloyd Smith och föreslog en förbĂ€ttrad sekvenseringsmetod dĂ€r varje typ av bas skulle fĂ€rgas i sin egen fĂ€rg. Denna idĂ© kunde fyrdubbla effektiviteten i Sangers process. Vid sekvensering av Sanger bildas en unik uppsĂ€ttning av oligonukleotider av olika lĂ€ngd i varje av de fyra provrören (enligt antalet baser), med hjĂ€lp av DNA-polymeras, som inkluderar primer-sekvensen. DĂ€refter tillsattes formamid till provrören för att separera kedjorna och elektrofores genomfördes i polyakrylamidgele pĂ„ fyra spĂ„r. I Smiths och Hunkapillers version mĂ€rkts dideoxynukleotider med fyra olika fĂ€rgĂ€mnen och PCR utförs i ett enda provrör. Under elektroforesen i polyakrylamidgelet exciteras aktiviteten hos fĂ€rgĂ€mnena pĂ„ en viss plats av en laserstrĂ„le, och detektorn bestĂ€mmer vilken nukleotid som för tillfĂ€llet migrerar genom gelen. Först var Smith pessimistisk â han fruktade att anvĂ€ndningen av extremt smĂ„ doser fĂ€rgĂ€mne skulle leda till att nukleotidsekvenserna blev otydliga. Men efter att han hade en utmĂ€rkt förstĂ„else för laserteknologier, hittade han snart en lösning genom att anvĂ€nda speciella fluorescerande fĂ€rgĂ€mnen som fluorescerar under pĂ„verkan av laserstrĂ„lning.
(FullstĂ€ndig version â 4,08 MB) Litet meddelande: DNA-sekvensen, avkodad med hjĂ€lp av en automatisk sekvenserare, erhĂ„llen frĂ„n apparaten för automatisk sekvensering. Varje fĂ€rg motsvarar en av de fyra baserna.
I den klassiska versionen av Sangers metod fungerar en av kedjorna av den analyserade DNA:n som en mall för syntesen av en komplementÀr kedja med DNA-polymeras, varefter sekvensen av DNA-fragment sorteras i en gel efter storlek. Varje fragment som inkluderas i DNA:t under syntesen och möjliggör efterföljande visualisering av reaktionsprodukterna mÀrks med en fluorescerande fÀrgÀmne som motsvarar det terminala basparet (detta nÀmndes pÄ s. 124); dÀrmed kommer fluorescensen av detta fragment att vara en identifierare för denna bas. Sedan ÄterstÄr det bara att genomföra detektering och visualisera reaktionsprodukterna. Resultaten analyseras med hjÀlp av en dator och presenteras som en sekvens av flerfÀrgade toppar som motsvarar de fyra nukleotiderna. DÀrefter överförs informationen direkt till datorns informationssystem, vilket eliminerar den tidskrÀvande och ibland plÄgsamma dataingÄngsprocessen som komplicerade sekvenseringen avsevÀrt.
â För mer information om boken kan man lĂ€sa pĂ„
»
»
För Habr-följare Ă€r det 25 % rabatt med koden â PCR
KĂ€lla: habr.com
