Den amerikanske nobelpristagaren i kemi Kary Mullis dog i Kalifornien vid 74 års ålder. Enligt hans fru inträffade dödsfallet den 7 augusti. Orsaken är hjärt- och andningssvikt på grund av lunginflammation.
James Watson själv, upptäckaren av DNA-molekylen, kommer att berätta om hans bidrag till biokemin och som han fick Nobelpriset för.
Utdrag ur boken av James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Den genetiska revolutionens historia
Kapitel 7. Människans genom. Livsscenario
.
Polymeraskedjereaktionen (PCR) uppfanns 1983 av biokemisten Carey Mullis, som arbetade på Cetus. Upptäckten av denna reaktion var ganska anmärkningsvärd. Mullis erinrade sig senare: ”En fredagskväll i april 1983 fick jag en uppenbarelse. Jag satt bakom ratten och körde nerför en månbelyst, slingrande bergsväg i norra Kalifornien, redwoodskogarnas land.” Det är imponerande att det var i en sådan situation som inspirationen slog honom. Och det är inte så att norra Kalifornien har speciella vägar som främjar insikt; det är bara det att hans vän en gång såg Mullis rusa hänsynslöst längs en isig dubbel körbana och det störde honom inte alls. En vän berättade för New York Times: "Mullis hade en vision att han skulle dö genom att krascha in i ett redwoodträd. Därför är han inte rädd för någonting när han kör, såvida det inte växer redwoodträd längs vägen.” Närvaron av redwoods längs vägen tvingade Mullis att koncentrera sig och... här var det, en insikt. Mullis fick Nobelpriset i kemi för sin uppfinning 1993 och har sedan dess blivit ännu främmare i sitt agerande. Han är till exempel en anhängare av den revisionistiska teorin att AIDS inte är relaterat till hiv, vilket avsevärt undergrävde hans eget rykte och störde läkarna.
PCR är en ganska enkel reaktion. För att utföra det behöver vi två kemiskt syntetiserade primrar som är komplementära till de motsatta ändarna av olika strängar av det nödvändiga DNA-fragmentet. Primers är korta sektioner av enkelsträngat DNA, var och en cirka 20 baspar långa. Det speciella med primrar är att de motsvarar de DNA-sektioner som behöver amplifieras, det vill säga DNA-mallen.
(Klickbar bild) Kary Mullis, uppfinnare av PCR
Specificiteten för PCR är baserad på bildningen av komplementära komplex mellan mallen och primers, korta syntetiska oligonukleotider. Varje primer är komplementär till en av strängarna i den dubbelsträngade mallen och begränsar början och slutet av den amplifierade regionen. Faktum är att den resulterande "matrisen" är ett helt genom, och vårt mål är att isolera de fragment av intresse för oss från den. För att göra detta värms den dubbelsträngade DNA-mallen till 95 °C i flera minuter för att separera DNA-strängarna. Detta stadium kallas denaturering eftersom vätebindningarna mellan de två DNA-strängarna bryts. När strängarna väl har separerats sänks temperaturen för att tillåta primrarna att binda till den enkelsträngade mallen. DNA-polymeras börjar DNA-replikation genom att binda till en sträcka av nukleotidkedjan. Enzymet DNA-polymeras replikerar mallsträngen med användning av en primer som primer eller exempel för kopiering. Som ett resultat av den första cykeln får vi flera sekventiell fördubbling av en viss DNA-sektion. Därefter upprepar vi denna procedur. Efter varje cykel får vi ett målområde i dubbel kvantitet. Efter tjugofem PCR-cykler (det vill säga på mindre än två timmar) har vi DNA-regionen av intresse för oss i en mängd som är 225 gånger högre än originalet (det vill säga vi har amplifierat det cirka 34 miljoner gånger). Faktum är att vi vid ingången fick en blandning av primrar, mall-DNA, DNA-polymerasenzymet och fria baser A, C, G och T, mängden av en specifik reaktionsprodukt (begränsad av primrarna) växer exponentiellt, och antalet av "långa" DNA-kopior är linjära, så i reaktion dominerar produkter.
Amplifiering av den önskade DNA-sektionen: polymeraskedjereaktion
Under de första dagarna av PCR var huvudproblemet följande: efter varje uppvärmnings-kylningscykel måste DNA-polymeras tillsättas till reaktionsblandningen, eftersom den inaktiverades vid en temperatur på 95 ° C. Därför var det nödvändigt att lägga till det igen före var och en av de 25 cyklerna. Reaktionsförfarandet var relativt ineffektivt, krävde mycket tid och polymerasenzymet, och materialet var mycket dyrt. Som tur var kom Moder Natur till undsättning. Många djur känner sig bekväma vid temperaturer mycket högre än 37 °C. Varför blev siffran 37 °C viktig för oss? Detta hände eftersom denna temperatur är optimal för E. coli, från vilken polymerasenzymet för PCR ursprungligen erhölls. I naturen finns mikroorganismer vars proteiner under miljontals år av naturligt urval har blivit mer motståndskraftiga mot höga temperaturer. Det har föreslagits att använda DNA-polymeraser från termofila bakterier. Dessa enzymer visade sig vara termostabila och klarade många reaktionscykler. Deras användning gjorde det möjligt att förenkla och automatisera PCR. Ett av de första termostabila DNA-polymeraserna isolerades från bakterien Thermus aquaticus, som lever i de varma källorna i Yellowstone National Park, och fick namnet Taq-polymeras.
PCR blev snabbt arbetshästen i Human Genome Project. I allmänhet skiljer sig processen inte från den som utvecklats av Mullis, den har precis automatiserats. Vi var inte längre beroende av en skara skumma doktorander som mödosamt hällde vätskedroppar i plastprovrör. I moderna laboratorier som bedriver molekylär genetisk forskning utförs detta arbete på robottransportörer. PCR-robotar involverade i ett sekvenseringsprojekt lika stort som det mänskliga genomet arbetar obevekligt med enorma volymer av värmestabilt polymeras. Vissa forskare som arbetade på Human Genome Project blev upprörda över de orimligt höga royalties som lagts till kostnaden för förbrukningsvaror av ägaren av PCR-patentet, den europeiska industriläkemedelsjätten Hoffmann-LaRoche.
En annan "drivprincip" var själva DNA-sekvenseringsmetoden. Den kemiska grunden för denna metod var inte längre ny på den tiden: Interstate Human Genome Project (HGP) antog samma geniala metod som Fred Sanger hade utvecklat redan i mitten av 1970-talet. Innovationen låg i omfattningen och graden av automatisering som sekvensering kunde uppnå.
Automatiserad sekvensering utvecklades ursprungligen i Lee Hoods laboratorium vid California Institute of Technology. Han gick gymnasiet i Montana och spelade collegefotboll som quarterback; Tack vare Hood vann laget delstatsmästerskapet mer än en gång. Hans samarbetsförmåga kom också väl till pass i hans vetenskapliga karriär. Hoods laboratorium bemannades av en brokig besättning av kemister, biologer och ingenjörer, och hans laboratorium blev snart ledande inom teknisk innovation.
Faktum är att den automatiserade sekvenseringsmetoden uppfanns av Lloyd Smith och Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, som då arbetade i Hoods laboratorium, vände sig till Lloyd Smith med ett förslag på en förbättrad sekvenseringsmetod där varje typ av bas skulle färgas olika. En sådan idé skulle kunna fyrdubbla effektiviteten i Sanger-processen. I Sanger, vid sekvensering i vart och ett av fyra rör (enligt antalet baser), med deltagande av DNA-polymeras, bildas en unik uppsättning oligonukleotider av olika längder, inklusive en primersekvens. Därefter tillsattes formamid till rören för kedjeseparation och polyakrylamidgelelektrofores utfördes på fyra banor. I Smith och Hunkapillers version är dideoxinukleotider märkta med fyra olika färgämnen och PCR utförs i ett rör. Sedan, under polyakrylamidgelelektrofores, exciterar en laserstråle på en specifik plats på gelén färgämnenas aktivitet, och detektorn bestämmer vilken nukleotid som för närvarande migrerar genom gelén. Till en början var Smith pessimistisk - han fruktade att användning av ultralåga doser av färgämne skulle leda till att nukleotidregionerna inte kunde särskiljas. Men med en utmärkt förståelse för laserteknik hittade han snart en väg ut ur situationen genom att använda speciella fluorokromfärger som fluorescerar när de utsätts för laserstrålning.
(Full version - 4,08 MB) Finstilt: DNA-sekvens sekvenserad med en automatisk sekvenserare, erhållen från en automatisk sekvenseringsmaskin. Varje färg motsvarar en av fyra baser
I den klassiska versionen av Sanger-metoden fungerar en av strängarna i det analyserade DNA:t som en mall för syntesen av en komplementär sträng av enzymet DNA-polymeras, sedan sorteras sekvensen av DNA-fragment i en gel efter storlek. Varje fragment, som ingår i DNA:t under syntes och möjliggör efterföljande visualisering av reaktionsprodukter, är märkt med ett fluorescerande färgämne som motsvarar den terminala basen (detta diskuterades på sid. 124); därför kommer fluorescensen av detta fragment att vara en identifierare för en given bas. Sedan återstår bara att utföra detektion och visualisera reaktionsprodukterna. Resultaten analyseras med dator och presenteras som en sekvens av flerfärgade toppar motsvarande fyra nukleotider. Informationen överförs sedan direkt till datorns informationssystem, vilket eliminerar den tidskrävande och ibland smärtsamma datainmatningsprocessen som gjorde sekvensering mycket svår.
» Mer information om boken finns på
»
»
För Khabrozhiteley 25% rabatt med kupong - PCR
Källa: will.com