కెమిస్ట్రీలో అమెరికన్ నోబెల్ గ్రహీత కారీ ముల్లిస్ 74 సంవత్సరాల వయస్సులో కాలిఫోర్నియాలో మరణించారు. అతని భార్య ప్రకారం, ఆగస్టు 7 న మరణం సంభవించింది. కారణం న్యుమోనియా కారణంగా గుండె మరియు శ్వాసకోశ వైఫల్యం.
DNA అణువును కనుగొన్న జేమ్స్ వాట్సన్ స్వయంగా జీవరసాయన శాస్త్రానికి ఆయన చేసిన కృషి గురించి మరియు దానికి నోబెల్ బహుమతిని పొందడం గురించి చెబుతారు.
జేమ్స్ వాట్సన్, ఆండ్రూ బెర్రీ, కెవిన్ డేవిస్ పుస్తకం నుండి సారాంశం
DNA. జన్యు విప్లవం యొక్క చరిత్ర
అధ్యాయం 7. మానవ జన్యువు. జీవిత దృశ్యం
...
పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్ (PCR)ని 1983లో సెటస్‌లో పనిచేసిన బయోకెమిస్ట్ కారీ ముల్లిస్ కనుగొన్నారు. ఈ ప్రతిచర్య యొక్క ఆవిష్కరణ చాలా గొప్పది. ముల్లిస్ తర్వాత ఇలా గుర్తుచేసుకున్నాడు: “ఏప్రిల్ 1983లో ఒక శుక్రవారం సాయంత్రం, నాకు ఎపిఫనీ వచ్చింది. రెడ్‌వుడ్ అడవులకు చెందిన ఉత్తర కాలిఫోర్నియాలో వెన్నెల వెలుతురు, వంకరగా ఉండే పర్వత రహదారిపై డ్రైవింగ్ చేస్తూ నేను చక్రం వెనుక ఉన్నాను. అలాంటి పరిస్థితుల్లోనే అతడికి స్ఫూర్తి తగిలిందని ఆకట్టుకుంది. మరియు ఉత్తర కాలిఫోర్నియాలో అంతర్దృష్టిని ప్రోత్సహించే ప్రత్యేక రహదారులు ఉన్నాయని కాదు; అతని స్నేహితుడు ఒకసారి ముల్లిస్ మంచుతో నిండిన డ్యూయల్ క్యారేజ్‌వేలో నిర్లక్ష్యంగా వేగంగా వెళ్లడం చూశాడు మరియు అది అతనికి ఏమాత్రం ఇబ్బంది కలిగించలేదు. ఒక స్నేహితుడు న్యూయార్క్ టైమ్స్‌తో ఇలా అన్నాడు: “ముల్లిస్‌కు రెడ్‌వుడ్ చెట్టును ఢీకొని చనిపోతాడని ఒక దృష్టి ఉంది. అందువల్ల, రోడ్డు పక్కన ఎర్రచెట్లు పెరిగితే తప్ప, డ్రైవింగ్ చేసేటప్పుడు అతను దేనికీ భయపడడు. దారి పొడవునా రెడ్‌వుడ్‌లు ఉండటం వల్ల ముల్లిస్ ఏకాగ్రత వహించవలసి వచ్చింది మరియు... ఇదిగో ఒక అంతర్దృష్టి. ముల్లిస్ 1993లో తన ఆవిష్కరణకు రసాయన శాస్త్రంలో నోబెల్ బహుమతిని అందుకున్నాడు మరియు అప్పటి నుండి అతని చర్యలలో మరింత అపరిచితుడు అయ్యాడు. ఉదాహరణకు, అతను AIDS HIVకి సంబంధించినది కాదని రివిజనిస్ట్ సిద్ధాంతానికి మద్దతుదారుడు, ఇది అతని స్వంత ప్రతిష్టను గణనీయంగా దెబ్బతీసింది మరియు వైద్యులతో జోక్యం చేసుకుంది.
PCR అనేది చాలా సులభమైన ప్రతిచర్య. దీన్ని అమలు చేయడానికి, మనకు అవసరమైన DNA శకలం యొక్క విభిన్న తంతువుల వ్యతిరేక చివరలకు అనుబంధంగా ఉండే రెండు రసాయనికంగా సంశ్లేషణ చేయబడిన ప్రైమర్‌లు అవసరం. ప్రైమర్‌లు సింగిల్-స్ట్రాండ్ DNA యొక్క చిన్న విభాగాలు, ఒక్కొక్కటి 20 బేస్ జతల పొడవు. ప్రైమర్‌ల యొక్క ప్రత్యేకత ఏమిటంటే అవి విస్తరించాల్సిన DNA విభాగాలకు, అంటే DNA టెంప్లేట్‌కు అనుగుణంగా ఉంటాయి.
(చిత్రం క్లిక్ చేయదగినది) కారీ ముల్లిస్, PCR యొక్క ఆవిష్కర్త
PCR యొక్క విశిష్టత టెంప్లేట్ మరియు ప్రైమర్‌లు, షార్ట్ సింథటిక్ ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌ల మధ్య కాంప్లిమెంటరీ కాంప్లెక్స్‌ల ఏర్పాటుపై ఆధారపడి ఉంటుంది. ప్రతి ప్రైమర్ డబుల్ స్ట్రాండెడ్ టెంప్లేట్ యొక్క స్ట్రాండ్‌లలో ఒకదానికి అనుబంధంగా ఉంటుంది మరియు విస్తరించిన ప్రాంతం యొక్క ప్రారంభం మరియు ముగింపును పరిమితం చేస్తుంది. వాస్తవానికి, ఫలితంగా వచ్చే “మాతృక” మొత్తం జన్యువు, మరియు దాని నుండి మనకు ఆసక్తి ఉన్న శకలాలు వేరుచేయడం మా లక్ష్యం. దీన్ని చేయడానికి, DNA తంతువులను వేరు చేయడానికి డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNA టెంప్లేట్ చాలా నిమిషాల పాటు 95 °Cకి వేడి చేయబడుతుంది. రెండు DNA తంతువుల మధ్య హైడ్రోజన్ బంధాలు విరిగిపోయినందున ఈ దశను డీనాటరేషన్ అంటారు. తంతువులు విడిపోయిన తర్వాత, ప్రైమర్‌లు సింగిల్-స్ట్రాండ్ టెంప్లేట్‌కు కట్టుబడి ఉండటానికి ఉష్ణోగ్రత తగ్గించబడుతుంది. DNA పాలిమరేస్ న్యూక్లియోటైడ్ గొలుసు యొక్క విస్తరణతో బంధించడం ద్వారా DNA ప్రతిరూపణను ప్రారంభిస్తుంది. DNA పాలిమరేస్ అనే ఎంజైమ్ టెంప్లేట్ స్ట్రాండ్‌ను ప్రైమర్‌గా లేదా కాపీ చేయడానికి ఉదాహరణగా ఉపయోగించి పునరావృతం చేస్తుంది. మొదటి చక్రం ఫలితంగా, మేము నిర్దిష్ట DNA విభాగం యొక్క బహుళ సీక్వెన్షియల్ రెట్టింపును పొందుతాము. తరువాత మేము ఈ విధానాన్ని పునరావృతం చేస్తాము. ప్రతి చక్రం తర్వాత మేము రెట్టింపు పరిమాణంలో లక్ష్య ప్రాంతాన్ని పొందుతాము. ఇరవై ఐదు PCR చక్రాల తర్వాత (అంటే, రెండు గంటల కంటే తక్కువ వ్యవధిలో), అసలు కంటే 225 రెట్లు ఎక్కువ (అంటే, మేము దానిని సుమారు 34 మిలియన్ రెట్లు పెంచాము) మనకు ఆసక్తి ఉన్న DNA ప్రాంతాన్ని కలిగి ఉన్నాము. వాస్తవానికి, ఇన్‌పుట్‌లో మేము ప్రైమర్‌లు, టెంప్లేట్ DNA, DNA పాలిమరేస్ ఎంజైమ్ మరియు ఉచిత బేస్‌లు A, C, G మరియు T మిశ్రమాన్ని అందుకున్నాము, నిర్దిష్ట ప్రతిచర్య ఉత్పత్తి మొత్తం (ప్రైమర్‌ల ద్వారా పరిమితం చేయబడింది) విపరీతంగా పెరుగుతుంది మరియు సంఖ్య "పొడవైన" DNA కాపీలు సరళంగా ఉంటాయి, కాబట్టి ప్రతిచర్య ఉత్పత్తులు ఆధిపత్యం చెలాయిస్తాయి.
కావలసిన DNA విభాగం యొక్క విస్తరణ: పాలిమరేస్ చైన్ రియాక్షన్
PCR యొక్క ప్రారంభ రోజులలో, ప్రధాన సమస్య క్రిందిది: ప్రతి తాపన-శీతలీకరణ చక్రం తర్వాత, DNA పాలిమరేస్ ప్రతిచర్య మిశ్రమానికి జోడించబడాలి, ఎందుకంటే ఇది 95 ° C ఉష్ణోగ్రత వద్ద నిష్క్రియం చేయబడింది. అందువల్ల, ప్రతి 25 చక్రాలకు ముందు దాన్ని మళ్లీ జోడించడం అవసరం. ప్రతిచర్య విధానం సాపేక్షంగా అసమర్థమైనది, చాలా సమయం మరియు పాలిమరేస్ ఎంజైమ్ అవసరం, మరియు పదార్థం చాలా ఖరీదైనది. అదృష్టవశాత్తూ, ప్రకృతి తల్లి రక్షించటానికి వచ్చింది. చాలా జంతువులు 37 °C కంటే ఎక్కువ ఉష్ణోగ్రతల వద్ద సుఖంగా ఉంటాయి. ఫిగర్ 37 °C మనకు ఎందుకు ముఖ్యమైనది? ఈ ఉష్ణోగ్రత E. coliకి అనుకూలమైనది కనుక ఇది జరిగింది, దీని నుండి PCR కోసం పాలీమరేస్ ఎంజైమ్ మొదట పొందబడింది. ప్రకృతిలో సూక్ష్మజీవులు ఉన్నాయి, దీని ప్రోటీన్లు, మిలియన్ల సంవత్సరాల సహజ ఎంపికలో, అధిక ఉష్ణోగ్రతలకు మరింత నిరోధకతను కలిగి ఉన్నాయి. థర్మోఫిలిక్ బ్యాక్టీరియా నుండి DNA పాలిమరేసెస్‌ను ఉపయోగించాలని ప్రతిపాదించబడింది. ఈ ఎంజైమ్‌లు థర్మోస్టేబుల్‌గా మారాయి మరియు అనేక ప్రతిచర్య చక్రాలను తట్టుకోగలవు. వారి ఉపయోగం PCR ను సరళీకృతం చేయడం మరియు ఆటోమేట్ చేయడం సాధ్యపడింది. ఎల్లోస్టోన్ నేషనల్ పార్క్‌లోని వేడి నీటి బుగ్గలలో నివసించే బాక్టీరియం థర్మస్ ఆక్వాటికస్ నుండి మొదటి థర్మోస్టేబుల్ DNA పాలిమరేస్‌లలో ఒకటి వేరుచేయబడింది మరియు దీనికి టాక్ పాలిమరేస్ అని పేరు పెట్టారు.
పిసిఆర్ త్వరగా హ్యూమన్ జీనోమ్ ప్రాజెక్ట్ యొక్క వర్క్‌హోర్స్‌గా మారింది. సాధారణంగా, ఈ ప్రక్రియ ముల్లిస్ అభివృద్ధి చేసిన దాని నుండి భిన్నంగా లేదు, ఇది ఇప్పుడే స్వయంచాలకంగా చేయబడింది. మేము ఇకపై మసకబారిన గ్రాడ్యుయేట్ విద్యార్థుల గుంపుపై ఆధారపడటం లేదు. పరమాణు జన్యు పరిశోధనను నిర్వహిస్తున్న ఆధునిక ప్రయోగశాలలలో, ఈ పని రోబోటిక్ కన్వేయర్‌లపై నిర్వహించబడుతుంది. హ్యూమన్ జీనోమ్ అంత పెద్ద సీక్వెన్సింగ్ ప్రాజెక్ట్‌లో పాల్గొన్న PCR రోబోట్‌లు భారీ వాల్యూమ్‌ల హీట్-స్టేబుల్ పాలిమరేస్‌తో అవిశ్రాంతంగా పనిచేస్తాయి. హ్యూమన్ జీనోమ్ ప్రాజెక్ట్‌లో పనిచేస్తున్న కొంతమంది శాస్త్రవేత్తలు PCR పేటెంట్ యజమాని, యూరోపియన్ ఇండస్ట్రియల్ ఫార్మాస్యూటికల్ దిగ్గజం Hoffmann-LaRoche ద్వారా తినుబండారాల ధరకు అసమంజసంగా అధిక రాయల్టీలు జోడించడం పట్ల ఆగ్రహం వ్యక్తం చేశారు.
మరొక "డ్రైవింగ్ సూత్రం" DNA సీక్వెన్సింగ్ పద్ధతి. ఈ పద్ధతి యొక్క రసాయన ఆధారం ఆ సమయంలో కొత్తది కాదు: ఇంటర్‌స్టేట్ హ్యూమన్ జీనోమ్ ప్రాజెక్ట్ (HGP) 1970ల మధ్యలో ఫ్రెడ్ సాంగర్ అభివృద్ధి చేసిన అదే తెలివిగల పద్ధతిని అవలంబించింది. సీక్వెన్సింగ్ సాధించగలిగిన ఆటోమేషన్ స్థాయి మరియు డిగ్రీలో ఆవిష్కరణ ఉంది.
ఆటోమేటెడ్ సీక్వెన్సింగ్ వాస్తవానికి కాలిఫోర్నియా ఇన్స్టిట్యూట్ ఆఫ్ టెక్నాలజీలోని లీ హుడ్ యొక్క ప్రయోగశాలలో అభివృద్ధి చేయబడింది. అతను మోంటానాలోని ఉన్నత పాఠశాలలో చదివాడు మరియు క్వార్టర్‌బ్యాక్‌గా కళాశాల ఫుట్‌బాల్ ఆడాడు; హుడ్‌కు ధన్యవాదాలు, జట్టు రాష్ట్ర ఛాంపియన్‌షిప్‌ను ఒకటి కంటే ఎక్కువసార్లు గెలుచుకుంది. అతని జట్టుకృషి నైపుణ్యాలు అతని శాస్త్రీయ వృత్తిలో కూడా ఉపయోగపడతాయి. హుడ్ యొక్క ప్రయోగశాలలో రసాయన శాస్త్రవేత్తలు, జీవశాస్త్రవేత్తలు మరియు ఇంజనీర్‌లతో కూడిన మోట్లీ సిబ్బంది ఉన్నారు మరియు అతని ప్రయోగశాల త్వరలో సాంకేతిక ఆవిష్కరణలలో అగ్రగామిగా మారింది.
వాస్తవానికి, ఆటోమేటెడ్ సీక్వెన్సింగ్ పద్ధతిని లాయిడ్ స్మిత్ మరియు మైక్ హుంకపిల్లర్ కనుగొన్నారు. మైక్ హంకాపిల్లర్, అప్పుడు హుడ్ యొక్క ప్రయోగశాలలో పని చేస్తూ, ప్రతి రకానికి భిన్నంగా రంగులు వేయబడే మెరుగైన సీక్వెన్సింగ్ పద్ధతి కోసం ఒక ప్రతిపాదనతో లాయిడ్ స్మిత్‌ను సంప్రదించాడు. అలాంటి ఆలోచన సాంగర్ ప్రక్రియ యొక్క సామర్థ్యాన్ని నాలుగు రెట్లు పెంచుతుంది. సాంగర్‌లో, DNA పాలిమరేస్ భాగస్వామ్యంతో ప్రతి నాలుగు ట్యూబ్‌లలో (బేస్‌ల సంఖ్య ప్రకారం) సీక్వెన్సింగ్ చేసినప్పుడు, ప్రైమర్ సీక్వెన్స్‌తో సహా వివిధ పొడవుల ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌ల యొక్క ఒక ప్రత్యేకమైన సెట్ ఏర్పడుతుంది. తరువాత, గొలుసు విభజన కోసం ట్యూబ్‌లకు ఫార్మామైడ్ జోడించబడింది మరియు నాలుగు లేన్‌లలో పాలీయాక్రిలమైడ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ ప్రదర్శించబడింది. స్మిత్ మరియు హుంకపిల్లర్ యొక్క సంస్కరణలో, డిడియోక్సిన్యూక్లియోటైడ్‌లు నాలుగు వేర్వేరు రంగులతో లేబుల్ చేయబడ్డాయి మరియు PCR ఒక ట్యూబ్‌లో ప్రదర్శించబడుతుంది. అప్పుడు, పాలియాక్రిలమైడ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ సమయంలో, జెల్‌పై ఒక నిర్దిష్ట ప్రదేశంలో ఉన్న లేజర్ పుంజం రంగుల కార్యాచరణను ఉత్తేజపరుస్తుంది మరియు ప్రస్తుతం జెల్ ద్వారా ఏ న్యూక్లియోటైడ్ తరలిపోతుందో డిటెక్టర్ నిర్ణయిస్తుంది. మొదట, స్మిత్ నిరాశావాది - అల్ట్రా-తక్కువ మోతాదుల రంగును ఉపయోగించడం వల్ల న్యూక్లియోటైడ్ ప్రాంతాలు వేరు చేయలేవని అతను భయపడ్డాడు. అయినప్పటికీ, లేజర్ టెక్నాలజీపై అద్భుతమైన అవగాహన కలిగి, లేజర్ రేడియేషన్‌కు గురైనప్పుడు ఫ్లోరోస్ అయ్యే ప్రత్యేక ఫ్లోరోక్రోమ్ డైలను ఉపయోగించడం ద్వారా అతను త్వరలోనే పరిస్థితి నుండి బయటపడటానికి ఒక మార్గాన్ని కనుగొన్నాడు.
(పూర్తి వెర్షన్ - 4,08 MB) ఫైన్ ప్రింట్: ఆటోమేటిక్ సీక్వెన్సింగ్ మెషీన్ నుండి పొందిన ఆటోమేటిక్ సీక్వెన్సర్‌ని ఉపయోగించి DNA సీక్వెన్స్ సీక్వెన్స్ చేయబడింది. ప్రతి రంగు నాలుగు బేస్‌లలో ఒకదానికి అనుగుణంగా ఉంటుంది
సాంగర్ పద్ధతి యొక్క క్లాసిక్ వెర్షన్‌లో, విశ్లేషించబడిన DNA యొక్క తంతువులలో ఒకటి ఎంజైమ్ DNA పాలిమరేస్ ద్వారా పరిపూరకరమైన స్ట్రాండ్ యొక్క సంశ్లేషణ కోసం ఒక టెంప్లేట్‌గా పనిచేస్తుంది, అప్పుడు DNA శకలాలు యొక్క క్రమం పరిమాణం ప్రకారం జెల్‌లో క్రమబద్ధీకరించబడుతుంది. సంశ్లేషణ సమయంలో DNAలో చేర్చబడిన మరియు ప్రతిచర్య ఉత్పత్తుల యొక్క తదుపరి విజువలైజేషన్‌ను అనుమతించే ప్రతి భాగం టెర్మినల్ బేస్‌కు సంబంధించిన ఫ్లోరోసెంట్ డైతో లేబుల్ చేయబడుతుంది (ఇది p. 124లో చర్చించబడింది); కాబట్టి, ఈ శకలం యొక్క ఫ్లోరోసెన్స్ ఇచ్చిన బేస్ కోసం ఐడెంటిఫైయర్ అవుతుంది. ప్రతిచర్య ఉత్పత్తులను గుర్తించడం మరియు దృశ్యమానం చేయడం మాత్రమే మిగిలి ఉంది. ఫలితాలు కంప్యూటర్ ద్వారా విశ్లేషించబడతాయి మరియు నాలుగు న్యూక్లియోటైడ్‌లకు సంబంధించిన బహుళ-రంగు శిఖరాల క్రమం వలె ప్రదర్శించబడతాయి. సమాచారం ఆ తర్వాత కంప్యూటర్ యొక్క సమాచార వ్యవస్థకు నేరుగా బదిలీ చేయబడుతుంది, సీక్వెన్సింగ్‌ను చాలా కష్టతరం చేసే సమయం తీసుకునే మరియు కొన్నిసార్లు బాధాకరమైన డేటా ఎంట్రీ ప్రక్రియను తొలగిస్తుంది.
» పుస్తకం గురించి మరిన్ని వివరాలను ఇక్కడ చూడవచ్చు
»
»
Khabrozhiteley కోసం కూపన్ ఉపయోగించి 25% తగ్గింపు - PCR
మూలం: www.habr.com