Барандаи ҷоизаи Нобели амрикоӣ дар бахши кимиё Кэри Маллис дар синни 74-солагӣ дар Калифорния даргузашт. Ба гуфтаи ҳамсараш, марг рӯзи 7 август рух додааст. Сабабаш нокомии дил ва нафаскашӣ аз илтиҳоби пневмония мебошад.
Худи Ҷеймс Уотсон, кашфкунандаи молекулаи ДНК, дар бораи саҳми ӯ дар биохимия ва барои он ҷоизаи Нобелро гирифтан ба мо нақл мекунад.
Иқтибос аз китоби Ҷеймс Уотсон, Эндрю Берри, Кевин Дэвис
ДНК. Таърихи инқилоби генетикӣ
Боби 7. Геномҳои инсон. Сенарияи ҳаёт
...
Реаксияи занҷири полимеразӣ (PCR) соли 1983 аз ҷониби биохимики Кэри Муллис, ки дар Cetus кор мекард, ихтироъ шудааст. Кашфи ин реакция хеле чолиби диккат буд. Муллис баъдтар ба хотир овард: «Як бегоҳи ҷумъаи моҳи апрели соли 1983 ман як ҳисси эҳсосотӣ доштам. Ман дар паси руль нишаста, бо роҳи пурпечутоби кӯҳии моҳтобӣ дар Калифорнияи Шимолӣ, сарзамини ҷангалҳои сурх ҳаракат мекардам». Чолиби диккат аст, ки махз дар чунин вазъият ба у илхом мезад. Ва ин нест, ки дар шимоли Калифорния роҳҳои махсусе дорад, ки ба фаҳмиш мусоидат мекунанд; танҳо он аст, ки дӯсташ боре дидааст, ки Муллис дар роҳи мошингарди дугонаи яхбаста беэҳтиётона суръат медавад ва ин ӯро ҳеҷ ташвиш намедиҳад. Як дӯсташ ба New York Times гуфт: "Муллис дар рӯъё буд, ки вай ба дарахти сурхчае бархӯрда мемирад. Аз ин рӯ, ҳангоми рондани мошин аз чизе наметарсад, магар дар канори роҳ дарахтони сурх нашъунамо кунанд». Мавҷудияти сурхчаҳои қад-қади роҳ Муллисро маҷбур кард, ки тамаркуз кунад ва... инак, як фаҳмиш буд. Муллис дар соли 1993 барои ихтироъаш ҷоизаи Нобел дар бахши кимиёро гирифт ва аз он вақт инҷониб дар амалҳои худ боз ҳам бегонатар шуд. Масалан, вай тарафдори назарияи ревизионистӣ мебошад, ки СПИД ба ВНМО иртибот надорад, ки обрӯи шахсии ӯро хеле паст кард ва ба табибон халал расонд.
PCR реаксияи хеле содда аст. Барои иҷрои он ба мо ду праймери аз ҷиҳати химиявӣ синтезшуда лозим аст, ки ба ақсои муқобили риштаҳои гуногуни порчаи ДНК лозиманд. Праймерҳо қисмҳои кӯтоҳи ДНК-и якқатор мебошанд, ки дарозии ҳар яки онҳо тақрибан 20 ҷуфти пойгоҳ доранд. Хусусияти праймерҳо дар он аст, ки онҳо ба бахшҳои ДНК, ки бояд тақвият дода шаванд, яъне қолаби ДНК мувофиқат мекунанд.
(Тасвирро клик кардан мумкин аст) Кари Муллис, ихтироъкори PCR
Хусусияти ПТР ба ташаккули комплексҳои комплементарӣ дар байни қолабҳо ва праймерҳо, олигонуклеотидҳои кӯтоҳи синтетикӣ асос ёфтааст. Ҳар як праймер ба яке аз риштаҳои қолаби дуқабата иловагӣ мебошад ва ибтидо ва охири минтақаи пурқувватшударо маҳдуд мекунад. Дарвоқеъ, «матрица»-и натиҷавӣ як геном аст ва ҳадафи мо ҷудо кардани порчаҳои барои мо ҷолиб аз он аст. Барои ин, қолаби дуқатораи ДНК-ро барои ҷудо кардани риштаҳои ДНК дар тӯли якчанд дақиқа то 95 °C гарм мекунанд. Ин марҳиларо денатуратсия меноманд, зеро пайвандҳои гидрогении байни ду риштаи ДНК канда мешаванд. Пас аз ҷудо шудани риштаҳо, ҳарорат паст карда мешавад, то ки праймерҳо ба қолаби якқатор пайваст шаванд. Полимеразаи ДНК репликатсияи ДНК-ро тавассути пайвастшавӣ ба як қисми занҷири нуклеотидҳо оғоз мекунад. Ферментҳои полимеразаи ДНК риштаи шаблонро бо истифода аз праймер ҳамчун праймер ё мисол барои нусхабардорӣ такрор мекунад. Дар натиҷаи давраи аввал, мо дучандон пайдарпайи як қисми муайяни ДНК-ро ба даст меорем. Минбаъд ин тартибро такрор мекунем. Пас аз ҳар як давра мо як майдони мавриди ҳадафро ба миқдори дукарата ба даст меорем. Пас аз бисту панҷ давраи ПТР (яъне дар давоми камтар аз ду соат), мо минтақаи ДНК-ро барои мо ба миқдори 225 маротиба зиёдтар аз асли худ дорем (яъне мо онро тақрибан 34 миллион маротиба тақвият додем). Дарвоқеъ, ҳангоми воридшавӣ мо омехтаи праймерҳо, қолаби ДНК, ферменти полимеразаи ДНК ва асосҳои озоди A, C, G ва T гирифтем, миқдори маҳсулоти реаксияи мушаххас (бо праймерҳо маҳдуд) ба таври экспоненсиалӣ меафзояд ва шумораи Нусхаи "дароз"-и ДНК хаттӣ аст, бинобар ин дар реаксия маҳсулот бартарӣ дорад.
Амплификацияи бахши дилхоҳи ДНК: реаксияи занҷири полимераз
Дар рӯзҳои аввали ПТР мушкилоти асосӣ ин буд: пас аз ҳар як давраи гармкунӣ-сардкунӣ, полимерази ДНК бояд ба омехтаи реаксия илова карда шавад, зеро он дар ҳарорати 95 ° C ғайрифаъол карда шуд. Аз ин ру, пеш аз хар 25 давра онро аз нав зам кардан лозим омад. Тартиби реаксия нисбатан бесамар буд, вақти зиёд ва ферменти полимеразро талаб мекард ва мавод хеле гарон буд. Хушбахтона, табиати модар ба ёрй омад. Бисёре аз ҳайвонот дар ҳарорати хеле баландтар аз 37 ° C худро бароҳат ҳис мекунанд. Чаро рақами 37 °C барои мо муҳим шуд? Ин аз он сабаб рӯй дод, ки ин ҳарорат барои E. coli мувофиқ аст, ки аз он ферменти полимераз барои PCR ибтидо гирифта шудааст. Дар табиат микроорганизмхое хастанд, ки сафедахояшон дар давоми миллионхо сол дар натичаи интихоби табии ба харорати баланд тобовартар шудааст. Истифодаи полимеразаҳои ДНК аз бактерияҳои термофилӣ пешниҳод шудааст. Ин ферментҳо ба термостабъ табдил ёфтанд ва ба бисёр давраҳои реаксия тоб оварда тавонистанд. Истифодаи онҳо имкон дод, ки PCR содда ва автоматӣ карда шавад. Яке аз аввалин полимеразҳои термостабли ДНК аз бактерияи Thermus aquaticus, ки дар чашмаҳои гарми Боғи Миллии Йеллоустоун зиндагӣ мекунад, ҷудо карда шуд ва онро Так полимераз номиданд.
PCR зуд ба аспи кори лоиҳаи геноми инсон табдил ёфт. Умуман, процесс аз процессе, ки Муллис кор карда баромадааст, фарке надорад, вай навакак автоматй кунонда шудааст. Мо дигар ба издиҳоми аспирантҳои хирадманд вобаста набудем, ки бо заҳмат ба пробиркаҳои пластикӣ қатраҳои моеъ мерехтанд. Дар лабораторияхои хозиразамон, ки тадкикоти молекулй-генетикй мегузаронанд, ин кор дар конвейерхои роботй ичро карда мешавад. Роботҳои PCR, ки дар як лоиҳаи пайдарпайӣ ба мисли геноми инсон иштирок мекунанд, беист бо ҳаҷми бузурги полимерази ба гармӣ устувор кор мекунанд. Баъзе олимоне, ки дар лоиҳаи геноми инсон кор мекунанд, аз роялти беасос баланд ба арзиши маводи истеъмолӣ аз ҷониби соҳиби патенти PCR, азими фармасевтии саноатии аврупоӣ Ҳоффман-ЛаРош ба хашм омадаанд.
Дигар "принсипи ронандагӣ" худи усули пайдарпайии ДНК буд. Асоси кимиёвии ин усул дар он вақт дигар нав набуд: Лоиҳаи байнидавлатии геноми инсон (HGP) ҳамон усули боақлонаеро, ки Фред Сэнгер дар миёнаи солҳои 1970 таҳия карда буд, қабул кард. Навоварӣ дар миқёс ва дараҷаи автоматикунонӣ буд, ки пайдарпай ба он ноил шуда буд.
Пайдарбандии автоматӣ дар лабораторияи Ли Ҳуд дар Донишкадаи технологии Калифорния таҳия шудааст. Ӯ дар мактаби миёна дар Монтана таҳсил кардааст ва футболи коллеҷро ҳамчун чорякбоз бозӣ мекард; Ба шарофати Гуд команда на як бору ду бор голиби чемпионати давлат гардид. Маҳорати кори дастаҷамъонаи ӯ дар фаъолияти илмии ӯ низ муфид буд. Лабораторияи Гуд бо як бригадаи рангоранги химикхо, биологхо ва инженерон кор мекард ва лабораторияи вай дере нагузашта пешсафи навоварии технологй гардид.
Дарвоқеъ, усули автоматии пайдарпайро Ллойд Смит ва Майк Ҳанкапиллер ихтироъ кардаанд. Майк Ханкапиллер, ки он вақт дар лабораторияи Ҳуд кор мекард, ба Ллойд Смит бо пешниҳоди усули такмилёфтаи пайдарпайкунӣ муроҷиат кард, ки дар он ҳар як намуди пойгоҳ ба таври гуногун ранг карда мешавад. Чунин идея метавонад самаранокии раванди Сангерро чор маротиба зиёд кунад. Дар Сангер хангоми дар хар як чор найча (мувофики шумораи асосхо) секвенсия бо иштироки полимеразаи ДНК мачмуи беназири олигонуклеотидхои дарозиашон гуногун, аз чумла пайдарпаии праймер ба вучуд меояд. Баъдан, ба қубурҳо барои ҷудо кардани занҷир формамид илова карда шуд ва дар чор роҳ электрофорези гели полиакриламид анҷом дода шуд. Дар версияи Смит ва Хункапиллер дидеоксинуклеотидҳо бо чор рангҳои гуногун нишон дода шудаанд ва ПТР дар як қубур гузаронида мешавад. Сипас, ҳангоми электрофорези гели полиакриламидӣ, нури лазерӣ дар як макони мушаххаси гел фаъолияти рангҳоро ба ҳаяҷон меорад ва детектор муайян мекунад, ки кадом нуклеотид дар айни замон тавассути гел ҳаракат мекунад. Дар аввал, Смит пессимист буд - ӯ метарсид, ки истифодаи миқдори ултра пасти ранг боиси номуайян шудани минтақаҳои нуклеотидҳо мегардад. Бо вуҷуди ин, ӯ дар бораи технологияи лазерӣ фаҳмиши аъло дошт, ӯ ба зудӣ роҳи халосиро аз вазъ бо истифода аз рангҳои махсуси фторохромӣ ёфт, ки ҳангоми таъсири шуоъҳои лазерӣ флуоресссия мекунанд.
(Нусхаи пурра - 4,08 МБ) Чопи хуб: пайдарпаии ДНК бо истифода аз секвенсери автоматӣ, ки аз мошини пайдарпайии автоматӣ гирифта шудааст. Ҳар як ранг ба яке аз чаҳор асос мувофиқат мекунад
Дар варианти классикии усули Сангер, яке аз риштаҳои ДНК-и таҳлилшуда ҳамчун қолаби синтези риштаи комплементарӣ аз ҷониби ферментҳои полимеразаи ДНК баромад мекунад, пас пайдарпаии пораҳои ДНК дар гел аз рӯи андоза ҷудо карда мешавад. Ҳар як порчае, ки дар вақти синтез ба ДНК дохил мешавад ва имкон медиҳад, ки визуализатсияи минбаъдаи маҳсулоти реаксияро фароҳам оварад, бо ранги флуоресцентӣ, ки ба пойгоҳи терминал мувофиқ аст, нишон дода мешавад (дар ин бора дар саҳ. 124 муҳокима карда шуд); аз ин рӯ, флуорессенсияи ин порча идентификатор барои пойгоҳи додашуда хоҳад буд. Он гоҳ ҳама чизи боқимонда анҷом додани ошкор ва визуализатсияи маҳсулоти реаксия аст. Натиҷаҳо тавассути компютер таҳлил карда мешаванд ва ҳамчун пайдарпаии қуллаҳои гуногунранг, ки ба чор нуклеотид мувофиқанд, пешниҳод карда мешаванд. Пас аз он иттилоот бевосита ба системаи иттилоотии компютер интиқол дода мешавад, ки раванди воридшавии маълумотро, ки вақти зиёдро талаб мекунад ва баъзан дарднок мегардонад, аз байн мебарад.
» Тафсилоти бештар дар бораи китобро метавонед дар ин ҷо пайдо кунед
»
»
Барои Khabrozhiteley 25% тахфиф бо истифода аз купон - PCR
Манбаъ: will.com