แครี่ มัลลิส เจ้าของรางวัลโนเบล ผู้ประดิษฐ์ปฏิกิริยาลูกโซ่ดีเอ็นเอโพลีเมอเรส เสียชีวิตแล้ว

Kary Mullis ผู้ได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมีชาวอเมริกัน เสียชีวิตในแคลิฟอร์เนียด้วยวัย 74 ปี ตามที่ภรรยาของเขากล่าวไว้ การเสียชีวิตเกิดขึ้นในวันที่ 7 สิงหาคม สาเหตุคือหัวใจและระบบหายใจล้มเหลวเนื่องจากโรคปอดบวม

James Watson ผู้ค้นพบโมเลกุล DNA จะบอกเราเกี่ยวกับการมีส่วนร่วมของเขาในด้านชีวเคมีและทำให้เขาได้รับรางวัลโนเบล

ตัดตอนมาจากหนังสือโดย เจมส์ วัตสัน, แอนดรูว์ เบอร์รี่, เควิน เดวิส

ดีเอ็นเอ. ประวัติศาสตร์การปฏิวัติทางพันธุกรรม

บทที่ 7 จีโนมมนุษย์ สถานการณ์ชีวิต

...
ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ถูกประดิษฐ์ขึ้นในปี 1983 โดยนักชีวเคมี Carey Mullis ซึ่งทำงานที่ Cetus การค้นพบปฏิกิริยานี้ค่อนข้างน่าทึ่ง มัลลิสเล่าในภายหลังว่า “เย็นวันศุกร์วันหนึ่งในเดือนเมษายน ปี 1983 ข้าพเจ้ามีความศักดิ์สิทธิ์ ฉันอยู่หลังพวงมาลัย ขับรถไปตามถนนบนภูเขาที่คดเคี้ยวและเต็มไปด้วยแสงจันทร์ทางตอนเหนือของแคลิฟอร์เนีย ดินแดนแห่งป่าเรดวู้ด” เป็นที่น่าประทับใจที่เขาได้รับแรงบันดาลใจในสถานการณ์เช่นนี้ และไม่ใช่ว่าทางตอนเหนือของแคลิฟอร์เนียจะมีถนนพิเศษที่ส่งเสริมความเข้าใจลึกซึ้ง เพียงแต่เพื่อนของเขาเคยเห็นมัลลิสเร่งความเร็วไปตามทางคู่ที่เป็นน้ำแข็งอย่างไม่ระมัดระวัง และมันก็ไม่ได้รบกวนเขาเลย เพื่อนคนหนึ่งเล่าให้นิวยอร์กไทม์สฟังว่า “มัลลิสมีนิมิตว่าเขาจะตายเพราะชนต้นไม้เรดวู้ด ดังนั้นเขาจึงไม่กลัวสิ่งใดในขณะขับรถเว้นแต่จะมีต้นสนแดงเติบโตตามถนน” การปรากฏตัวของไม้เรดวูดตามถนนทำให้ Mullis ต้องตั้งสมาธิ และ... นี่คือข้อมูลเชิงลึก Mullis ได้รับรางวัลโนเบลสาขาเคมีจากการประดิษฐ์ของเขาในปี 1993 และตั้งแต่นั้นมาก็กลายเป็นคนแปลกหน้าในการกระทำของเขา ตัวอย่างเช่น เขาเป็นผู้สนับสนุนทฤษฎีแก้ไขที่ว่าโรคเอดส์ไม่เกี่ยวข้องกับเอชไอวี ซึ่งทำลายชื่อเสียงของเขาเองอย่างมากและแทรกแซงแพทย์

PCR เป็นปฏิกิริยาที่ค่อนข้างง่าย ในการดำเนินการนี้ เราจำเป็นต้องมีไพรเมอร์สังเคราะห์ทางเคมีสองตัวที่เข้าคู่กับปลายด้านตรงข้ามของสายที่แตกต่างกันของชิ้นส่วน DNA ที่ต้องการ ไพรเมอร์เป็นส่วนสั้นๆ ของ DNA สายเดี่ยว ซึ่งแต่ละส่วนมีความยาวประมาณ 20 คู่เบส ลักษณะเฉพาะของไพรเมอร์คือ พวกมันสอดคล้องกับส่วน DNA ที่ต้องขยาย ซึ่งก็คือเทมเพลต DNA

(คลิกรูปภาพได้) Kary Mullis ผู้ประดิษฐ์ PCR

ความจำเพาะของ PCR ขึ้นอยู่กับการก่อตัวของสารเชิงซ้อนเสริมระหว่างเทมเพลตและไพรเมอร์ซึ่งเป็นโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์สั้น ไพรเมอร์แต่ละตัวจะเข้าคู่กับหนึ่งในเกลียวของเทมเพลตที่มีเกลียวคู่ และจำกัดจุดเริ่มต้นและจุดสิ้นสุดของขอบเขตที่ขยาย ในความเป็นจริง "เมทริกซ์" ที่ได้คือจีโนมทั้งหมด และเป้าหมายของเราคือการแยกชิ้นส่วนที่เราสนใจออกจากมัน เมื่อต้องการทำเช่นนี้ เทมเพลต DNA แบบเกลียวคู่จะถูกให้ความร้อนถึง 95 °C เป็นเวลาหลายนาทีเพื่อแยกสาย DNA ระยะนี้เรียกว่าการสูญเสียสภาพเนื่องจากพันธะไฮโดรเจนระหว่างสาย DNA ทั้งสองเส้นถูกทำลาย เมื่อเกลียวแยกออกจากกัน อุณหภูมิจะลดลงเพื่อให้ไพรเมอร์ยึดติดกับแม่แบบที่มีเกลียวเดี่ยวได้ DNA polymerase เริ่มการจำลอง DNA โดยการจับกับสายโซ่นิวคลีโอไทด์ที่ยืดออก เอนไซม์ DNA polymerase จำลองเกลียวแม่แบบโดยใช้ไพรเมอร์เป็นไพรเมอร์หรือตัวอย่างสำหรับการคัดลอก จากผลของรอบแรก เราได้รับการเพิ่มทวีคูณตามลำดับหลายเท่าของส่วน DNA บางส่วน ต่อไปเราจะทำซ้ำขั้นตอนนี้ หลังจากแต่ละรอบ เราจะได้พื้นที่เป้าหมายในปริมาณสองเท่า หลังจากรอบ PCR ยี่สิบห้ารอบ (นั่นคือภายในเวลาไม่ถึงสองชั่วโมง) เราก็มีบริเวณ DNA ที่เราสนใจมากกว่าเดิมถึง 225 เท่า (นั่นคือ เราได้ขยายมันไปประมาณ 34 ล้านครั้ง) ในความเป็นจริง ที่อินพุตเราได้รับส่วนผสมของไพรเมอร์, เทมเพลต DNA, เอนไซม์ DNA polymerase และเบสอิสระ A, C, G และ T ปริมาณของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาเฉพาะ (จำกัดโดยไพรเมอร์) จะเพิ่มขึ้นแบบทวีคูณ และจำนวน สำเนา DNA ที่ "ยาว" มีลักษณะเป็นเส้นตรง ดังนั้นในผลิตภัณฑ์ที่ทำปฏิกิริยาจึงมีอิทธิพลเหนือกว่า

การขยายส่วน DNA ที่ต้องการ: ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส

ในช่วงแรกของ PCR ปัญหาหลักมีดังต่อไปนี้: หลังจากแต่ละรอบการให้ความร้อน-ความเย็น จะต้องเติม DNA polymerase ลงในส่วนผสมของปฏิกิริยา เนื่องจากมันถูกปิดใช้งานที่อุณหภูมิ 95 ° C ดังนั้นจึงจำเป็นต้องเพิ่มอีกครั้งก่อนแต่ละรอบ 25 รอบ ขั้นตอนการทำปฏิกิริยาค่อนข้างไม่มีประสิทธิภาพ ต้องใช้เวลาและเอนไซม์โพลีเมอเรสมาก และวัสดุมีราคาแพงมาก โชคดีที่แม่ธรรมชาติเข้ามาช่วยเหลือ สัตว์หลายชนิดรู้สึกสบายที่อุณหภูมิสูงกว่า 37 °C มาก ทำไมตัวเลข 37 °C จึงมีความสำคัญสำหรับเรา? สิ่งนี้เกิดขึ้นเนื่องจากอุณหภูมินี้เหมาะสมที่สุดสำหรับเชื้อ E. coli ซึ่งมาจากเอนไซม์โพลีเมอเรสสำหรับ PCR ในตอนแรก ในธรรมชาติมีจุลินทรีย์หลายชนิดซึ่งโปรตีนซึ่งผ่านการคัดสรรโดยธรรมชาติมาหลายล้านปีสามารถทนต่ออุณหภูมิสูงได้ดีกว่า มีการเสนอให้ใช้ DNA polymerase จากแบคทีเรียที่ชอบความร้อน เอนไซม์เหล่านี้ทนความร้อนได้และสามารถทนต่อรอบปฏิกิริยาได้หลายรอบ การใช้งานทำให้สามารถลดความซับซ้อนและทำให้ PCR เป็นอัตโนมัติได้ หนึ่งใน DNA polymerase ที่ทนความร้อนได้กลุ่มแรกๆ ถูกแยกได้จากแบคทีเรีย Thermus Aquaticus ซึ่งอาศัยอยู่ในบ่อน้ำพุร้อนของอุทยานแห่งชาติเยลโลว์สโตน และได้รับการตั้งชื่อว่า Taq polymerase

PCR กลายเป็นส่วนสำคัญของโครงการจีโนมมนุษย์อย่างรวดเร็ว โดยทั่วไป กระบวนการนี้ไม่แตกต่างจากกระบวนการที่ Mullis พัฒนาขึ้น แต่เป็นเพียงแค่ระบบอัตโนมัติเท่านั้น เราไม่ได้พึ่งพานักศึกษาระดับบัณฑิตศึกษาที่ปัญญาอ่อนจำนวนมากที่พยายามเทหยดของเหลวลงในหลอดทดลองพลาสติกอีกต่อไป ในห้องปฏิบัติการสมัยใหม่ที่ทำการวิจัยเกี่ยวกับอณูพันธุศาสตร์ งานนี้ดำเนินการบนสายพานลำเลียงแบบหุ่นยนต์ หุ่นยนต์ PCR มีส่วนร่วมในโครงการหาลำดับขนาดใหญ่เท่ากับจีโนมมนุษย์ทำงานอย่างไม่หยุดยั้งกับโพลีเมอเรสที่มีความเสถียรต่อความร้อนปริมาณมหาศาล นักวิทยาศาสตร์บางคนที่ทำงานในโครงการจีโนมมนุษย์รู้สึกไม่พอใจกับค่าลิขสิทธิ์ที่สูงเกินสมควรซึ่งบวกกับต้นทุนของวัสดุสิ้นเปลืองโดยเจ้าของสิทธิบัตร PCR ซึ่งเป็นบริษัทเภสัชภัณฑ์ยักษ์ใหญ่ด้านอุตสาหกรรมของยุโรป ฮอฟฟ์มันน์-ลาโรช

“หลักการขับเคลื่อน” อีกประการหนึ่งคือวิธีการจัดลำดับดีเอ็นเอนั่นเอง พื้นฐานทางเคมีของวิธีการนี้ไม่ใช่เรื่องใหม่อีกต่อไปในเวลานั้น โครงการจีโนมมนุษย์ระหว่างรัฐ (HGP) ได้นำวิธีการอันชาญฉลาดแบบเดียวกับที่ Fred Sanger ได้พัฒนาขึ้นในช่วงกลางทศวรรษ 1970 มาใช้ นวัตกรรมนี้อยู่ในขนาดและระดับของระบบอัตโนมัติที่การจัดลำดับสามารถทำได้

การจัดลำดับอัตโนมัติได้รับการพัฒนาครั้งแรกในห้องทดลองของ Lee Hood ที่สถาบันเทคโนโลยีแคลิฟอร์เนีย เขาเข้าเรียนที่โรงเรียนมัธยมในมอนทานาและเล่นฟุตบอลระดับวิทยาลัยในตำแหน่งกองหลัง ต้องขอบคุณฮูดที่ทำให้ทีมคว้าแชมป์ระดับรัฐได้มากกว่าหนึ่งครั้ง ทักษะการทำงานเป็นทีมของเขามีประโยชน์ในอาชีพทางวิทยาศาสตร์ของเขาด้วย ห้องทดลองของฮูดมีทีมงานมากมายซึ่งประกอบด้วยนักเคมี นักชีววิทยา และวิศวกร และในไม่ช้าห้องทดลองของเขาก็กลายเป็นผู้นำด้านนวัตกรรมทางเทคโนโลยี

ในความเป็นจริง วิธีการเรียงลำดับอัตโนมัติถูกคิดค้นโดย Lloyd Smith และ Mike Hunkapiller ไมค์ ฮังคาพิลเลอร์ ซึ่งขณะนั้นทำงานในห้องทดลองของฮู้ด ได้เข้าหาลอยด์ สมิธพร้อมข้อเสนอสำหรับวิธีการจัดลำดับที่ได้รับการปรับปรุง โดยที่ฐานแต่ละประเภทจะมีสีที่แตกต่างกัน แนวคิดดังกล่าวอาจเพิ่มประสิทธิภาพของกระบวนการแซงเจอร์เป็นสี่เท่า ใน Sanger เมื่อจัดลำดับในแต่ละหลอดจากสี่หลอด (ตามจำนวนฐาน) โดยการมีส่วนร่วมของ DNA polymerase ชุดโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่เป็นเอกลักษณ์ที่มีความยาวต่างกันจะเกิดขึ้นรวมถึงลำดับไพรเมอร์ด้วย จากนั้น เติมฟอร์มาไมด์ลงในท่อสำหรับการแยกโซ่ และทำโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิสบนสี่เลน ในเวอร์ชันของ Smith และ Hunkapiller นั้น Dideoxynucleotides จะมีป้ายกำกับด้วยสีย้อมที่แตกต่างกัน XNUMX สี และดำเนินการ PCR ในหลอดเดียว จากนั้น ในระหว่างกระบวนการโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส ลำแสงเลเซอร์ที่ตำแหน่งเฉพาะบนเจลจะกระตุ้นการทำงานของสีย้อม และเครื่องตรวจจับจะตรวจสอบว่านิวคลีโอไทด์ใดที่กำลังเคลื่อนที่ผ่านเจลอยู่ ในตอนแรก สมิธมองโลกในแง่ร้าย เขากลัวว่าการใช้สีย้อมในปริมาณที่ต่ำมากจะทำให้บริเวณนิวคลีโอไทด์แยกไม่ออก อย่างไรก็ตาม ด้วยความเข้าใจอย่างดีเยี่ยมเกี่ยวกับเทคโนโลยีเลเซอร์ ในไม่ช้า เขาก็พบทางออกจากสถานการณ์นี้โดยใช้สีย้อมฟลูออโรโครมพิเศษที่จะเรืองแสงเมื่อสัมผัสกับรังสีเลเซอร์

(เวอร์ชันเต็ม โดยคลิก - 4,08 MB) การพิมพ์แบบละเอียด: ลำดับ DNA เรียงลำดับโดยใช้เครื่องหาลำดับอัตโนมัติ ซึ่งได้มาจากเครื่องหาลำดับอัตโนมัติ แต่ละสีสอดคล้องกับหนึ่งในสี่ฐาน

ในวิธี Sanger เวอร์ชันคลาสสิก หนึ่งในสายของ DNA ที่วิเคราะห์ทำหน้าที่เป็นแม่แบบสำหรับการสังเคราะห์สายเสริมโดยเอนไซม์ DNA polymerase จากนั้นลำดับของชิ้นส่วน DNA จะถูกจัดเรียงในเจลตามขนาด แต่ละชิ้นส่วนซึ่งรวมอยู่ใน DNA ในระหว่างการสังเคราะห์และช่วยให้มองเห็นผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาในภายหลังนั้นจะมีป้ายกำกับด้วยสีย้อมฟลูออเรสเซนต์ที่สอดคล้องกับฐานปลาย (ซึ่งมีการกล่าวถึงในหน้า 124) ดังนั้นการเรืองแสงของชิ้นส่วนนี้จะเป็นตัวระบุฐานที่กำหนด สิ่งที่เหลืออยู่คือการตรวจจับและแสดงภาพผลิตภัณฑ์ที่เกิดปฏิกิริยา ผลลัพธ์จะถูกวิเคราะห์ด้วยคอมพิวเตอร์และนำเสนอเป็นลำดับของพีคหลายสีที่สอดคล้องกับนิวคลีโอไทด์สี่ตัว จากนั้นข้อมูลจะถูกถ่ายโอนไปยังระบบข้อมูลของคอมพิวเตอร์โดยตรง ช่วยลดขั้นตอนป้อนข้อมูลที่ใช้เวลานานและบางครั้งก็ยุ่งยาก ซึ่งทำให้การจัดลำดับเป็นเรื่องยากมาก

» ดูรายละเอียดหนังสือเพิ่มเติมได้ที่ เว็บไซต์ของผู้จัดพิมพ์
» สารบัญ
» ข้อความที่ตัดตอนมา

สำหรับ Khabrozhiteley ส่วนลด 25% โดยใช้คูปอง - PCR

ที่มา: will.com