Ang American Nobel laureate sa chemistry na si Kary Mullis ay namatay sa California sa edad na 74. Ayon sa kanyang asawa, naganap ang kamatayan noong Agosto 7. Ang sanhi ay pagkabigo sa puso at paghinga dahil sa pulmonya.
Si James Watson mismo, ang nakatuklas ng molekula ng DNA, ay magsasabi sa atin tungkol sa kanyang kontribusyon sa biochemistry at kung saan natanggap niya ang Nobel Prize.
Sipi mula sa aklat ni James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Kasaysayan ng Genetic Revolution
Kabanata 7. Human genome. Sitwasyon sa buhay
...
Ang polymerase chain reaction (PCR) ay naimbento noong 1983 ng biochemist na si Carey Mullis, na nagtrabaho sa Cetus. Ang pagtuklas ng reaksyong ito ay medyo kapansin-pansin. Nang maglaon ay naalaala ni Mullis: βIsang gabi ng Biyernes noong Abril 1983, nagkaroon ako ng epiphany. Ako ang nasa likod ng manibela, nagmamaneho sa isang naliliwanagan ng buwan, paliku-likong kalsada sa bundok sa Northern California, ang lupain ng mga kagubatan ng redwood.β Kahanga-hanga na nasa ganoong sitwasyon ang inspirasyon niya. At hindi ang hilagang California ay may mga espesyal na kalsada na nagtataguyod ng pananaw; minsan na nga lang nakita ng kaibigan niya si Mullis na walang ingat na nagmamadali sa isang nagyeyelong dalawahang karwahe at hindi ito nag-abala sa kanya. Sinabi ng isang kaibigan sa New York Times: "Nakita ni Mullis na mamamatay siya sa pagbangga sa isang puno ng redwood. Samakatuwid, hindi siya natatakot sa anumang bagay habang nagmamaneho, maliban kung may mga puno ng redwood na tumutubo sa kalsada." Ang pagkakaroon ng mga redwood sa kahabaan ng kalsada ay nagpilit kay Mullis na mag-concentrate at... narito ito, isang pananaw. Natanggap ni Mullis ang Nobel Prize sa Chemistry para sa kanyang imbensyon noong 1993 at mula noon ay naging mas estranghero sa kanyang mga aksyon. Halimbawa, siya ay isang tagasuporta ng rebisyunistang teorya na ang AIDS ay hindi nauugnay sa HIV, na makabuluhang nagpapahina sa kanyang sariling reputasyon at nakagambala sa mga doktor.
Ang PCR ay isang medyo simpleng reaksyon. Upang maisakatuparan ito, kailangan namin ng dalawang chemically synthesized primer na pantulong sa magkabilang dulo ng iba't ibang mga hibla ng kinakailangang fragment ng DNA. Ang mga panimulang aklat ay maiikling seksyon ng single-stranded DNA, bawat isa ay humigit-kumulang 20 base pairs ang haba. Ang kakaiba ng mga panimulang aklat ay ang mga ito ay tumutugma sa mga seksyon ng DNA na kailangang palakihin, iyon ay, ang template ng DNA.
(Naa-click ang larawan) Kary Mullis, imbentor ng PCR
Ang pagtitiyak ng PCR ay batay sa pagbuo ng mga pantulong na kumplikado sa pagitan ng template at mga primer, maikling synthetic oligonucleotides. Ang bawat panimulang aklat ay komplementaryo sa isa sa mga strand ng double-stranded na template at nililimitahan ang simula at dulo ng amplified na rehiyon. Sa katunayan, ang nagresultang "matrix" ay isang buong genome, at ang aming layunin ay ihiwalay ang mga fragment ng interes sa amin mula dito. Upang gawin ito, ang double-stranded na template ng DNA ay pinainit sa 95 Β°C sa loob ng ilang minuto upang paghiwalayin ang mga hibla ng DNA. Ang yugtong ito ay tinatawag na denaturation dahil ang hydrogen bonds sa pagitan ng dalawang DNA strands ay nasira. Kapag naghiwalay na ang mga hibla, ibinababa ang temperatura upang payagan ang mga panimulang aklat na magbigkis sa single-stranded na template. Sinisimulan ng DNA polymerase ang pagtitiklop ng DNA sa pamamagitan ng pagbubuklod sa isang kahabaan ng nucleotide chain. Ang enzyme DNA polymerase ay kinokopya ang template strand gamit ang isang primer bilang panimulang aklat o halimbawa para sa pagkopya. Bilang resulta ng unang cycle, nakakakuha kami ng maramihang sequential na pagdodoble ng isang partikular na seksyon ng DNA. Susunod na ulitin namin ang pamamaraang ito. Pagkatapos ng bawat cycle ay nakakakuha tayo ng target na lugar sa dobleng dami. Pagkatapos ng dalawampu't limang PCR cycle (iyon ay, sa mas mababa sa dalawang oras), mayroon kaming rehiyon ng DNA na interesado sa amin sa halagang 225 beses na mas mataas kaysa sa orihinal (iyon ay, pinalaki namin ito ng humigit-kumulang 34 milyong beses). Sa katunayan, sa input ay nakatanggap kami ng pinaghalong primer, template DNA, ang DNA polymerase enzyme at mga libreng base A, C, G at T, ang halaga ng isang partikular na produkto ng reaksyon (nililimitahan ng mga primer) ay lumalaki nang husto, at ang bilang ng "mahabang" mga kopya ng DNA ay linear, kaya sa reaksyon ay nangingibabaw ang mga produkto.
Pagpapalakas ng nais na seksyon ng DNA: polymerase chain reaction
Sa mga unang araw ng PCR, ang pangunahing problema ay ang mga sumusunod: pagkatapos ng bawat heating-cooling cycle, ang DNA polymerase ay kailangang idagdag sa reaction mixture, dahil hindi ito aktibo sa temperatura na 95 Β° C. Samakatuwid, ito ay kinakailangan upang muling idagdag ito bago ang bawat isa sa 25 cycle. Ang pamamaraan ng reaksyon ay medyo hindi mabisa, nangangailangan ng maraming oras at ang polymerase enzyme, at ang materyal ay napakamahal. Sa kabutihang palad, ang Inang Kalikasan ay sumagip. Maraming hayop ang kumportable sa temperaturang mas mataas sa 37 Β°C. Bakit naging mahalaga sa atin ang figure na 37 Β°C? Nangyari ito dahil ang temperatura na ito ay pinakamainam para sa E. coli, kung saan orihinal na nakuha ang polymerase enzyme para sa PCR. Sa kalikasan mayroong mga microorganism na ang mga protina, sa paglipas ng milyun-milyong taon ng natural na pagpili, ay naging mas lumalaban sa mataas na temperatura. Iminungkahi na gumamit ng DNA polymerases mula sa thermophilic bacteria. Ang mga enzyme na ito ay naging thermostable at nakayanan ang maraming mga siklo ng reaksyon. Ang kanilang paggamit ay naging posible upang pasimplehin at i-automate ang PCR. Ang isa sa mga unang thermostable DNA polymerases ay nahiwalay sa bacterium Thermus aquaticus, na nakatira sa mga hot spring ng Yellowstone National Park, at pinangalanang Taq polymerase.
Mabilis na naging workhorse ng Human Genome Project ang PCR. Sa pangkalahatan, ang proseso ay hindi naiiba sa isa na binuo ni Mullis, ito ay awtomatiko lamang. Hindi na kami umaasa sa isang pulutong ng mahihinang nagtapos na mga mag-aaral na maingat na nagbuhos ng mga patak ng likido sa mga plastic test tube. Sa mga modernong laboratoryo na nagsasagawa ng molecular genetic research, ang gawaing ito ay ginagawa sa mga robotic conveyor. Ang mga PCR robot na kasangkot sa isang sequencing project na kasing laki ng Human Genome ay walang tigil na gumagana sa malalaking volume ng heat-stable polymerase. Ang ilang mga siyentipiko na nagtatrabaho sa Human Genome Project ay nagalit sa hindi makatwirang mataas na royalties na idinagdag sa halaga ng mga consumable ng may-ari ng PCR patent, ang European industrial pharmaceutical giant na Hoffmann-LaRoche.
Ang isa pang "prinsipyo sa pagmamaneho" ay ang paraan ng pagkakasunud-sunod ng DNA mismo. Ang kemikal na batayan ng pamamaraang ito ay hindi na bago sa panahong iyon: ang Interstate Human Genome Project (HGP) ay nagpatibay ng parehong mapanlikhang pamamaraan na binuo ni Fred Sanger noong kalagitnaan ng 1970s. Ang inobasyon ay nasa sukat at antas ng automation na nagawang makamit ng sequencing.
Ang awtomatikong sequencing ay orihinal na binuo sa laboratoryo ni Lee Hood sa California Institute of Technology. Nag-aral siya sa high school sa Montana at naglaro ng football sa kolehiyo bilang quarterback; Salamat sa Hood, napanalunan ng koponan ang kampeonato ng estado nang higit sa isang beses. Ang kanyang mga kasanayan sa pagtutulungan ng magkakasama ay naging kapaki-pakinabang din sa kanyang pang-agham na karera. Ang laboratoryo ni Hood ay may tauhan ng isang motley crew ng mga chemist, biologist, at inhinyero, at ang kanyang laboratoryo sa lalong madaling panahon ay naging pinuno sa teknolohikal na pagbabago.
Sa katunayan, ang automated sequencing method ay naimbento nina Lloyd Smith at Mike Hunapilller. Si Mike Hunkapiller, noon ay nagtatrabaho sa laboratoryo ni Hood, ay lumapit kay Lloyd Smith na may panukala para sa isang pinahusay na paraan ng pagkakasunud-sunod kung saan ang bawat uri ng base ay iba-iba ang kulay. Ang ganitong ideya ay maaaring apat na beses ang kahusayan ng proseso ng Sanger. Sa Sanger, kapag ang pagkakasunud-sunod sa bawat isa sa apat na tubo (ayon sa bilang ng mga base), kasama ang pakikilahok ng DNA polymerase, isang natatanging hanay ng mga oligonucleotides na may iba't ibang haba ay nabuo, kabilang ang isang primer na pagkakasunud-sunod. Susunod, ang formamide ay idinagdag sa mga tubo para sa paghihiwalay ng kadena at ang polyacrylamide gel electrophoresis ay isinagawa sa apat na linya. Sa bersyon nina Smith at Hunkapiller, ang mga dideoxynucleotides ay may label na may apat na magkakaibang tina at ang PCR ay ginagawa sa isang tubo. Pagkatapos, sa panahon ng polyacrylamide gel electrophoresis, ang isang laser beam sa isang partikular na lokasyon sa gel ay nagpapasigla sa aktibidad ng mga tina, at tinutukoy ng detector kung aling nucleotide ang kasalukuyang lumilipat sa pamamagitan ng gel. Sa una, si Smith ay pessimistic - natakot siya na ang paggamit ng napakababang dosis ng dye ay hahantong sa mga rehiyon ng nucleotide na hindi makilala. Gayunpaman, sa pagkakaroon ng mahusay na pag-unawa sa teknolohiya ng laser, nakahanap siya ng paraan sa pag-alis sa sitwasyon sa pamamagitan ng paggamit ng mga espesyal na fluorochrome dyes na nag-fluoresce kapag nalantad sa laser radiation.
(Buong bersyon - 4,08 MB) Fine print: DNA sequenced gamit ang isang awtomatikong sequencer, na nakuha mula sa isang awtomatikong sequencing machine. Ang bawat kulay ay tumutugma sa isa sa apat na base
Sa klasikong bersyon ng pamamaraang Sanger, ang isa sa mga strand ng nasuri na DNA ay gumaganap bilang isang template para sa synthesis ng isang pantulong na strand ng enzyme DNA polymerase, pagkatapos ay ang pagkakasunud-sunod ng mga fragment ng DNA ay pinagsunod-sunod sa isang gel ayon sa laki. Ang bawat fragment, na kasama sa DNA sa panahon ng synthesis at nagbibigay-daan sa kasunod na visualization ng mga produkto ng reaksyon, ay may label na may fluorescent dye na naaayon sa terminal base (ito ay tinalakay sa p. 124); samakatuwid, ang fluorescence ng fragment na ito ay magiging isang identifier para sa isang partikular na base. Pagkatapos ang lahat na natitira ay upang magsagawa ng pagtuklas at mailarawan ang mga produkto ng reaksyon. Ang mga resulta ay sinusuri ng computer at ipinakita bilang isang pagkakasunud-sunod ng maraming kulay na mga taluktok na tumutugma sa apat na nucleotides. Ang impormasyon ay pagkatapos ay direktang inilipat sa sistema ng impormasyon ng computer, na inaalis ang nakakaubos ng oras at kung minsan ay masakit na proseso ng pagpasok ng data na nagpahirap sa sequencing.
Β» Higit pang mga detalye tungkol sa aklat ay matatagpuan sa
Β»
Β»
Para sa Khabrozhiteley 25% na diskwento gamit ang kupon - PCR
Pinagmulan: www.habr.com