Kimya alanında Nobel ödüllü Amerikalı Kary Mullis, 74 yaşında Kaliforniya'da öldü. Eşinin ifadesine göre ölüm 7 Ağustos'ta meydana geldi. Nedeni zatürreye bağlı kalp ve solunum yetmezliğidir.
DNA molekülünün kaşifi James Watson, biyokimyaya olan katkısını ve Nobel Ödülü'nü almasının nedenini bize bizzat anlatacak.
James Watson, Andrew Berry ve Kevin Davis'in kitabından alıntı
DNA. Genetik Devrimin Tarihi
Bölüm 7. İnsan genomu. Yaşam senaryosu
...
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), 1983 yılında Cetus'ta çalışan biyokimyacı Carey Mullis tarafından icat edildi. Bu reaksiyonun keşfi oldukça dikkat çekiciydi. Mullis daha sonra şunları hatırladı: “Nisan 1983'te bir Cuma akşamı bir aydınlanma yaşadım. Sekoya ormanlarının ülkesi olan Kuzey Kaliforniya'da ay ışığının aydınlattığı, dolambaçlı bir dağ yolunda direksiyon başındaydım. Böyle bir durumda ona ilham gelmesi etkileyici. Ve Kuzey Kaliforniya'da içgörüyü teşvik eden özel yolların olması da söz konusu değil; sadece arkadaşı bir keresinde Mullis'in buzlu çift şeritli yolda dikkatsizce hız yaptığını görmüş ve bu onu hiç rahatsız etmemişti. Bir arkadaşı New York Times'a şunları söyledi: “Mullis'in bir sekoya ağacına çarparak öleceğine dair bir vizyonu vardı. Bu nedenle yol boyunca sekoya ağaçları yetişmediği sürece araba kullanırken hiçbir şeyden korkmuyor.” Yol boyunca sekoya ağaçlarının varlığı Mullis'i konsantre olmaya zorladı ve... işte buradaydı, bir içgörü. Mullis, icadı nedeniyle 1993 yılında Nobel Kimya Ödülü'nü aldı ve o zamandan bu yana davranışlarıyla daha da tuhaflaştı. Örneğin, AIDS'in HIV ile bağlantılı olmadığı yönündeki revizyonist teorinin destekçisidir, bu da kendi itibarını önemli ölçüde baltalamış ve doktorların işine müdahale etmiştir.
PCR oldukça basit bir reaksiyondur. Bunu gerçekleştirmek için, gerekli DNA fragmanının farklı iplikçiklerinin zıt uçlarını tamamlayan, kimyasal olarak sentezlenmiş iki primere ihtiyacımız var. Primerler, her biri yaklaşık 20 baz çifti uzunluğunda olan tek sarmallı DNA'nın kısa bölümleridir. Primerlerin özelliği, çoğaltılması gereken DNA bölümlerine, yani DNA şablonuna karşılık gelmeleridir.
(Resme tıklanabilir) Kary Mullis, PCR'nin mucidi
PCR'nin özgüllüğü, şablon ve primerler arasında tamamlayıcı komplekslerin, kısa sentetik oligonükleotidlerin oluşumuna dayanır. Primerlerin her biri, çift sarmallı şablonun şeritlerinden birine tamamlayıcıdır ve çoğaltılmış bölgenin başlangıcını ve sonunu sınırlar. Aslında ortaya çıkan “matris” bütün bir genomdur ve amacımız bizi ilgilendiren parçaları ondan izole etmektir. Bunu yapmak için, çift sarmallı DNA şablonu, DNA sarmallarını ayırmak üzere birkaç dakika boyunca 95 °C'ye ısıtılır. Bu aşamaya denatürasyon denir çünkü iki DNA zinciri arasındaki hidrojen bağları kırılır. İplikler ayrıldıktan sonra, primerlerin tek iplikli şablona bağlanmasını sağlamak için sıcaklık düşürülür. DNA polimeraz, bir nükleotid zincirine bağlanarak DNA replikasyonunu başlatır. DNA polimeraz enzimi, kopyalama için bir primer veya örnek olarak bir primer kullanarak şablon zincirini çoğaltır. İlk döngünün bir sonucu olarak, belirli bir DNA bölümünün ardışık olarak birden fazla ikiye katlanmasını elde ederiz. Daha sonra bu işlemi tekrarlıyoruz. Her döngüden sonra iki katı miktarda bir hedef alan elde ederiz. Yirmi beş PCR döngüsünden sonra (yani iki saatten kısa bir sürede), ilgilendiğimiz DNA bölgesini orijinalinden 225 kat daha yüksek bir miktarda elde ediyoruz (yani onu yaklaşık 34 milyon kez çoğaltmışız). Aslında, girdide primerler, şablon DNA, DNA polimeraz enzimi ve serbest bazlar A, C, G ve T'den oluşan bir karışım aldık; belirli bir reaksiyon ürününün miktarı (primerlerle sınırlı) katlanarak artıyor ve sayı "Uzun" DNA kopyalarının sayısı doğrusaldır, dolayısıyla reaksiyonda ürünler baskındır.
İstenilen DNA bölümünün amplifikasyonu: polimeraz zincir reaksiyonu
PCR'nin ilk günlerinde asıl sorun şuydu: Her ısıtma-soğutma döngüsünden sonra, 95 ° C sıcaklıkta etkisiz hale getirilen DNA polimerazın reaksiyon karışımına eklenmesi gerekiyordu. Bu nedenle 25 döngünün her birinden önce yeniden eklenmesi gerekiyordu. Reaksiyon prosedürü nispeten verimsizdi, çok fazla zaman ve polimeraz enzimi gerektiriyordu ve malzeme çok pahalıydı. Neyse ki Doğa Ana kurtarmaya geldi. Birçok hayvan 37°C'nin çok üzerindeki sıcaklıklarda kendilerini rahat hisseder. 37 °C rakamı bizim için neden önemli hale geldi? Bunun gerçekleşmesinin nedeni, bu sıcaklığın, PCR için polimeraz enziminin orijinal olarak elde edildiği E. coli için optimal olmasıdır. Doğada, milyonlarca yıllık doğal seçilim sonucunda proteinleri yüksek sıcaklıklara daha dayanıklı hale gelen mikroorganizmalar vardır. Termofilik bakterilerden elde edilen DNA polimerazların kullanılması önerilmiştir. Bu enzimlerin termostabil olduğu ve birçok reaksiyon döngüsüne dayanabildiği ortaya çıktı. Bunların kullanımı PCR'nin basitleştirilmesini ve otomatikleştirilmesini mümkün kıldı. İlk termostabil DNA polimerazlardan biri, Yellowstone Milli Parkı'nın kaplıcalarında yaşayan Thermus Aquaticus bakterisinden izole edildi ve Taq polimeraz olarak adlandırıldı.
PCR kısa sürede İnsan Genomu Projesinin temel taşı haline geldi. Genel olarak süreç Mullis tarafından geliştirilen süreçten farklı değil, sadece otomatikleştirildi. Artık plastik test tüplerine titizlikle sıvı damlacıkları döken kör yüksek lisans öğrencilerinden oluşan bir kalabalığa bağımlı değildik. Moleküler genetik araştırmaları yürüten modern laboratuvarlarda bu çalışma robotik konveyörler üzerinde gerçekleştirilmektedir. İnsan Genomu kadar büyük bir dizileme projesinde yer alan PCR robotları, büyük miktarlarda ısıya dayanıklı polimeraz ile durmaksızın çalışır. İnsan Genomu Projesi üzerinde çalışan bazı bilim insanları, PCR patentinin sahibi Avrupalı endüstriyel ilaç devi Hoffmann-LaRoche'un sarf malzemelerinin maliyetine makul olmayan derecede yüksek telif ücretleri eklemesi karşısında öfkelendi.
Bir diğer "itici prensip" ise DNA dizileme yönteminin kendisiydi. Bu yöntemin kimyasal temeli o zamanlar artık yeni değildi: Eyaletlerarası İnsan Genomu Projesi (HGP), Fred Sanger'in 1970'lerin ortalarında geliştirdiği ustaca yöntemin aynısını benimsedi. Yenilik, sıralamanın başarabildiği otomasyonun ölçeğinde ve derecesinde yatıyordu.
Otomatik sıralama ilk olarak Lee Hood'un California Teknoloji Enstitüsü'ndeki laboratuvarında geliştirildi. Liseyi Montana'da okudu ve kolejde oyun kurucu olarak futbol oynadı; Hood sayesinde takım eyalet şampiyonluğunu birden fazla kez kazandı. Takım çalışması becerileri bilimsel kariyerinde de işe yaradı. Hood'un laboratuvarında kimyagerler, biyologlar ve mühendislerden oluşan çok çeşitli bir ekip vardı ve laboratuvarı kısa sürede teknolojik yeniliklerde lider haline geldi.
Aslında otomatik sıralama yöntemi Lloyd Smith ve Mike Hunkapiller tarafından icat edildi. O zamanlar Hood'un laboratuvarında çalışan Mike Hunkapiller, her baz tipinin farklı şekilde renklendirileceği gelişmiş bir sıralama yöntemi önerisiyle Lloyd Smith'e yaklaştı. Böyle bir fikir, Sanger sürecinin verimliliğini dört katına çıkarabilir. Sanger'de, DNA polimerazın katılımıyla dört tüpün her birinde (baz sayısına göre) sekanslama yapılırken, bir primer sekansı da dahil olmak üzere farklı uzunluklarda benzersiz bir oligonükleotid seti oluşturulur. Daha sonra zincir ayrımı için tüplere formamid eklendi ve dört şeritte poliakrilamid jel elektroforezi yapıldı. Smith ve Hunkapiller'in versiyonunda dideoksinükleotidler dört farklı boyayla etiketlenir ve PCR tek tüpte gerçekleştirilir. Daha sonra, poliakrilamid jel elektroforezi sırasında, jel üzerinde belirli bir konuma yerleştirilen bir lazer ışını, boyaların aktivitesini uyarır ve detektör, o anda hangi nükleotidin jelden geçmekte olduğunu belirler. Smith ilk başta kötümserdi; çok düşük dozda boya kullanmanın nükleotid bölgelerinin ayırt edilemez olmasına yol açacağından korkuyordu. Bununla birlikte, lazer teknolojisi konusunda mükemmel bir anlayışa sahip olduğundan, lazer radyasyonuna maruz kaldığında floresan ışık saçan özel florokrom boyalar kullanarak kısa sürede bu durumdan bir çıkış yolu buldu.
(Tam versiyon - 4,08 MB) İnce baskı: Otomatik dizileme makinesinden elde edilen, otomatik dizileyici kullanılarak dizilenen DNA dizisi. Her renk dört bazdan birine karşılık gelir
Sanger yönteminin klasik versiyonunda, analiz edilen DNA'nın iplikçiklerinden biri, DNA polimeraz enzimi tarafından tamamlayıcı bir ipliğin sentezi için bir şablon görevi görür, daha sonra DNA parçalarının dizisi, boyutuna göre bir jelde sıralanır. Sentez sırasında DNA'ya dahil edilen ve reaksiyon ürünlerinin daha sonra görselleştirilmesine izin veren her parça, terminal bazına karşılık gelen bir floresan boya ile etiketlenir (bu, s. 124'te tartışılmıştır); bu nedenle bu parçanın floresansı belirli bir baz için bir tanımlayıcı olacaktır. Daha sonra geriye kalan tek şey reaksiyon ürünlerini tespit etmek ve görselleştirmektir. Sonuçlar bilgisayar tarafından analiz edilir ve dört nükleotite karşılık gelen çok renkli tepe noktaları dizisi halinde sunulur. Bilgi daha sonra doğrudan bilgisayarın bilgi sistemine aktarılır ve sıralamayı çok zorlaştıran zaman alıcı ve bazen zahmetli veri giriş sürecini ortadan kaldırır.
» Kitapla ilgili daha detaylı bilgiye şu adresten ulaşabilirsiniz:
»
»
Khabrozhiteley için kupon kullanarak %25 indirim - PCR
Kaynak: habr.com