У Каліфорнії у віці 74 років помер американський нобелівський лауреат з хімії Кері Мулліс. За словами його дружини, смерть настала 7 серпня. Причина – серцева та дихальна недостатність через пневмонію.
Про те, який внесок він зробив у біохімію і за що отримав Нобелівську премію, нам розповість сам Джеймс Вотсон — першовідкривач молекули ДНК.
Уривок із книги Джеймса Вотсона, Ендрю Беррі, Кевіна Девіса
ДНК. Історія генетичної революції
Розділ 7. Геном людини. Сценарій життя
...
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) була винайдена в 1983 біохіміком Кері Муллісом, який працював у компанії Cetus. Відкриття цієї реакції було дуже примітним. Пізніше Мулліс згадував: «Якось п'ятничного вечора у квітні 1983 року мене ніби осяяло. Я був за кермом, котив по залитій місячним світлом звивистою гірською дорогою до Північної Каліфорнії, край секвойних лісів». Вражає, що саме у такій ситуації його відвідало натхнення. І річ зовсім не в тому, що на півночі Каліфорнії особливі дороги, що сприяють осяянню; просто його один раз бачив, як Мулліс безрозсудно мчав обмерзлою дорогою з двостороннім рухом і це його зовсім не бентежило. Друг розповів New York Times таке: «Мулісу здалося, що він загине, врізавшись у секвойю. Тому він нічого не боїться за кермом, якщо вздовж дороги не ростуть секвої». Наявність секвою вздовж дороги змушувала Мулліса зосередитись і… ось воно, осяяння. За свій винахід у 1993 році Мулліс отримав Нобелівську премію з хімії і з того часу став ще дивнішим у своїх вчинках. Наприклад, він є прихильником ревізіоністської теорії про те, що СНІД не пов'язаний з ВІЛ, чим значно підірвав власну репутацію і перешкодив лікарям.
ПЛР – досить проста реакція. Для її проведення нам потрібні два хімічно синтезовані праймери, комплементарні протилежним кінцям різних ланцюгів необхідного фрагмента ДНК. Праймери - це короткі ділянки однонитчастої ДНК, кожен приблизно по 20 пар основ у довжину. Особливість праймерів така, що вони відповідають ділянкам ДНК, які потрібно ампліфікувати, тобто ДНК-матриці.
(Зображення клікабельно) Кері Мулліс, винахідник ПЛР
Специфічність ПЛР заснована на утворенні комплементарних комплексів між матрицею та праймерами, короткими синтетичними олігонуклеотидами. Кожен з праймерів комплементарний одному з ланцюгів дволанцюжкової матриці і обмежує початок і кінець ділянки, що ампліфікується. Фактично отримана «матриця» є цілісним геномом, і наша мета — виділити з неї фрагменти, що цікавлять нас. Для цього дволанцюгову ДНК-матрицю нагрівають до 95 °C на кілька хвилин, щоб ланцюги ДНК розійшлися. Ця стадія називається денатурацією, оскільки руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами ДНК. Коли ланцюги розійшлися, температуру знижують, щоб праймери могли зв'язатися з матрицею одноланцюгової. ДНК-полімераза починає реплікацію ДНК, зв'язуючись із відрізком ланцюга нуклеотидів. Фермент ДНК-полімераза реплікує матричний ланцюг, використовуючи праймер як затравку або приклад для копіювання. В результаті першого циклу отримуємо багаторазове послідовне подвоєння певної ділянки ДНК. Далі ми повторюємо цю процедуру. Після кожного циклу отримуємо ділянку-мішень у подвійній кількості. Через двадцять п'ять циклів ПЛР (тобто менш ніж через дві години) маємо ділянку ДНК, яка нас цікавить, у кількості, що в 225 разів перевищує вихідне (тобто ми ампліфікували її приблизно в 34 мільйони разів). Фактично на вході у нас виходила суміш із праймерів, матричної ДНК, ферменту ДНК-полімерази та вільних основ А, Ц, Г і Т, кількість специфічного продукту реакції (обмеженого праймерами) зростає експоненційно, а кількість «довгих» копій ДНК лінійно, тому в продукти реакції домінують.
Ампліфікація потрібної ділянки ДНК: полімеразна ланцюгова реакція
На зорі використання ПЛР основна проблема полягала в наступному: після кожного циклу нагрівання-охолодження доводилося додавати реакційну суміш ДНК-полімеразу, так як вона інактивувалася при температурі 95 °C. Тому потрібно було заново додавати її перед кожним із 25 циклів. Процедура проведення реакції була порівняно неефективною, вимагала багато часу та ферменту полімерази, а матеріал це дуже недешевий. На щастя, на допомогу прийшла матінка-природа. Багато тварин відчувають себе комфортно при температурі набагато вище за 37 °C. А чому для нас стала важливою цифра 37 °C? Це сталося тому, що ця температура є оптимальною для E. coli, з якої вихідно отримували фермент полімеразу для ПЛР. У природі зустрічаються мікроорганізми, білки яких за мільйони років природного відбору стали більш стійкими до дії високих температур. Було запропоновано використовувати ДНК-полімерази із термофільних бактерій. Ці ферменти виявилися термостабільними і здатні витримувати безліч циклів реакції. Їх використання дозволило спростити та автоматизувати проведення ПЛР. Одна з перших термостабільних ДНК-полімераз була виділена з бактерії Thermus aquaticus, яка мешкає в гарячих джерелах Єллоустонського національного парку, і названа Taq-полімеразою.
ПЛР швидко перетворилася на головного робочого конячка проекту «Геном людини». Загалом процес не відрізняється від розробленого Муллісом, просто він був автоматизований. Ми більше не залежали від натовпу підсліпуватих аспірантів, які ретельно переливають крапельки рідини в пластикові пробірки. У сучасних лабораторіях, які здійснюють молекулярно-генетичні дослідження, ця робота виконується на роботизованих конвеєрах. ПЛР-роботи, зайняті в такому масштабному проекті із секвенування, як «Геном людини», невблаганно працюють з величезними обсягами термостійкої полімерази. Деякі вчені, які працюють у проекті "Геном людини", були обурені невиправдано високими відрахуваннями, які додає до вартості витратних матеріалів власник патенту на ПЛР, європейський індустріально-фармацевтичний гігант Hoffmann-LaRoche.
Іншим «рушійним початком» став сам метод секвенування ДНК. Хімічна основа цього методу на той час вже не була новинкою: Міждержавний проект «Геном людини» (HGP) взяв на озброєння той самий хитромудрий метод, що ще в середині 1970-х років розробив Фред Сенгер. Інновація ж полягала в масштабі та ступені автоматизації, яких вдалося досягти при секвенуванні.
Автоматичне секвенування спочатку розроблялося у лабораторії Лі Худа в Каліфорнійському технологічному інституті. Він закінчував школу в штаті Монтана та грав в американський футбол на позиції нападника; завдяки Худу команда неодноразово вигравала чемпіонат штату. Навички командної взаємодії нагоді йому і в науковій кар'єрі. У лабораторії Худа працювала строката компанія хіміків, біологів та інженерів, і незабаром його лабораторія вийшла в лідери щодо технологічних інновацій.
Фактично метод автоматичного секвенування винайшли Ллойд Сміт та Майк Хункапіллер. Майк Хункапіллер, який тоді працював у лабораторії Худа, звернувся до Ллойда Сміта, запропонувавши йому вдосконалений метод секвенування, в якому підстави кожного типу забарвлювалися б кожен у свій колір. Така ідея могла вчетверо підвищити ефективність сенгерівського процесу. У Сенгера при секвенуванні в кожній із чотирьох пробірок (за кількістю підстав) за участю ДНК-полімерази утворюється унікальний набір олігонуклеотидів різної довжини, що включають праймерну послідовність. Далі в пробірки додавали формамід для розходження ланцюгів та проводили електрофорез у поліакриламідному гелі на чотирьох доріжках. У варіанті Сміта та Хункапілера дідезоксинуклеотиди мітять чотирма різними барвниками та проводять ПЛР в одній пробірці. Потім під час електрофорезу поліакриламідному гелі промінь лазера в певному місці гелю збуджує активність барвників, і детектор визначає, який нуклеотид зараз мігрує через гель. Спочатку Сміт був налаштований песимістично - він побоювався, що використання надмалих доз барвника призведе до того, що нуклеотидні ділянки будуть невиразні. Однак, чудово розбираючись у лазерних технологіях, він незабаром знайшов вихід зі становища, використовуючи спеціальні флюорохромні барвники, які флуоресціюють під дією лазерного випромінювання.
(Повна версія - 4,08 МБ) Дрібним шрифтом: послідовність ДНК, що розшифрована з використанням автоматичного секвенатора, отримана з апарата для автоматичного секвенування. Кожному кольору відповідає одна з чотирьох підстав
У класичному варіанті методу Сенгера один з ланцюжків аналізованої ДНК виступає як матриця для синтезу комплементарного ланцюжка ферментом ДНК-полімеразою, потім послідовність фрагментів ДНК сортується в гелі за розміром. Кожен фрагмент, який включається до складу ДНК під час синтезу і дозволяє згодом візуалізувати продукти реакції, позначається флуоресцентним барвником, що відповідає термінальній підставі (про це йшлося на с. 124); отже, флюоресценція цього фрагмента буде ідентифікатором цієї підстави. Потім залишається лише провести детекцію та візуалізувати продукти реакції. Результати аналізують за допомогою комп'ютера та подають у вигляді послідовності різнокольорових піків, що відповідають чотирьом нуклеотидам. Далі інформація передається безпосередньо в інформаційну систему комп'ютера, що унеможливлює витратний за часом і часом болісний процес введення даних, який дуже ускладнював секвенування.
» Докладніше з книгою можна ознайомитись на
»
»
Для Хаброжителів знижка 25% купона ПЛР
Джерело: habr.com