ڈی این اے پولیمریز چین ری ایکشن کے موجد نوبل انعام یافتہ کیری ملس انتقال کر گئے ہیں۔

کیمسٹری میں نوبل انعام یافتہ امریکی کیری ملس 74 سال کی عمر میں کیلیفورنیا میں انتقال کر گئے۔ ان کی اہلیہ کے مطابق موت 7 اگست کو ہوئی تھی۔ اس کی وجہ نمونیا کی وجہ سے دل اور سانس کی خرابی ہے۔

خود ڈی این اے مالیکیول کے دریافت کرنے والے جیمز واٹسن ہمیں بائیو کیمسٹری میں اپنی شراکت کے بارے میں بتائیں گے اور جس کے لیے انہیں نوبل انعام ملا تھا۔

جیمز واٹسن، اینڈریو بیری، کیون ڈیوس کی کتاب سے اقتباس

ڈی این اے جینیاتی انقلاب کی تاریخ

باب 7۔ انسانی جینوم۔ زندگی کا منظر نامہ

...
پولیمریز چین ری ایکشن (PCR) کی ایجاد 1983 میں بائیو کیمسٹ کیری مولیس نے کی تھی، جو سیٹس میں کام کرتے تھے۔ اس ردعمل کی دریافت کافی قابل ذکر تھی۔ ملیس نے بعد میں یاد کیا: "اپریل 1983 میں ایک جمعہ کی شام، مجھے ایک ایپی فینی تھا۔ میں پہیے کے پیچھے تھا، ریڈ ووڈ کے جنگلات کی سرزمین شمالی کیلیفورنیا میں چاندنی، سمیٹتی ہوئی پہاڑی سڑک پر گاڑی چلا رہا تھا۔ یہ متاثر کن ہے کہ یہ ایسی حالت میں تھا کہ الہام نے اسے متاثر کیا۔ اور ایسا نہیں ہے کہ شمالی کیلیفورنیا میں خاص سڑکیں ہیں جو بصیرت کو فروغ دیتی ہیں۔ یہ صرف اتنا ہے کہ اس کے دوست نے ایک بار مولیس کو برفیلے دوہری کیریج وے پر لاپرواہی سے تیز رفتاری سے چلتے ہوئے دیکھا تھا اور اس نے اسے بالکل بھی پریشان نہیں کیا تھا۔ ایک دوست نے نیویارک ٹائمز کو بتایا: "مولس نے ایک خواب دیکھا تھا کہ وہ سرخ لکڑی کے درخت سے ٹکرا کر مر جائے گا۔ اس لیے وہ گاڑی چلاتے ہوئے کسی چیز سے نہیں ڈرتا، جب تک کہ سڑک کے ساتھ سرخ لکڑی کے درخت نہ اُگتے ہوں۔‘‘ سڑک کے ساتھ سرخ لکڑیوں کی موجودگی نے ملس کو توجہ مرکوز کرنے پر مجبور کیا اور... یہ ایک بصیرت تھی۔ ملس کو 1993 میں ان کی ایجاد کے لیے کیمسٹری کا نوبل انعام ملا اور اس کے بعد سے وہ اپنے اعمال میں اور بھی اجنبی ہو گئے ہیں۔ مثال کے طور پر، وہ اس نظر ثانی کے حامی ہیں کہ ایڈز کا تعلق ایچ آئی وی سے نہیں ہے، جس نے ان کی اپنی ساکھ کو نمایاں طور پر مجروح کیا اور ڈاکٹروں کے ساتھ مداخلت کی۔

پی سی آر کافی آسان ردعمل ہے۔ اسے انجام دینے کے لیے، ہمیں دو کیمیاوی طور پر ترکیب شدہ پرائمر کی ضرورت ہے جو کہ مطلوبہ ڈی این اے کے ٹکڑے کے مختلف کناروں کے مخالف سروں کے تکمیلی ہوں۔ پرائمر واحد پھنسے ہوئے ڈی این اے کے چھوٹے حصے ہیں، ہر ایک کی لمبائی تقریباً 20 بیس جوڑے ہیں۔ پرائمر کی خاصیت یہ ہے کہ وہ ڈی این اے کے ان حصوں سے مطابقت رکھتے ہیں جن کو بڑھانا ضروری ہے، یعنی ڈی این اے ٹیمپلیٹ۔

(تصویر قابل کلک) کیری مولیس، پی سی آر کے موجد

پی سی آر کی خصوصیت ٹیمپلیٹ اور پرائمر، مختصر مصنوعی اولیگونوکلیوٹائڈس کے درمیان تکمیلی کمپلیکس کی تشکیل پر مبنی ہے۔ ہر پرائمر ڈبل سٹرینڈ ٹیمپلیٹ کے کسی ایک اسٹرینڈ کا تکمیلی ہوتا ہے اور بڑھا ہوا خطے کے آغاز اور اختتام کو محدود کرتا ہے۔ درحقیقت، نتیجے میں "میٹرکس" ایک مکمل جینوم ہے، اور ہمارا مقصد اس سے ہمارے لیے دلچسپی کے ٹکڑوں کو الگ کرنا ہے۔ ایسا کرنے کے لیے، دوہرے پھنسے ہوئے ڈی این اے ٹیمپلیٹ کو 95 ڈگری سینٹی گریڈ پر کئی منٹوں کے لیے گرم کیا جاتا ہے تاکہ ڈی این اے اسٹرینڈز کو الگ کیا جا سکے۔ اس مرحلے کو ڈینیچریشن کہا جاتا ہے کیونکہ دو ڈی این اے اسٹرینڈز کے درمیان ہائیڈروجن بانڈ ٹوٹ جاتے ہیں۔ ایک بار جب اسٹرینڈ الگ ہو جاتے ہیں، تو درجہ حرارت کو کم کر دیا جاتا ہے تاکہ پرائمر سنگل سٹرینڈ ٹیمپلیٹ سے منسلک ہو سکیں۔ ڈی این اے پولیمریز نیوکلیوٹائڈ چین کے ایک حصے کو باندھ کر ڈی این اے کی نقل شروع کرتا ہے۔ اینزائم ڈی این اے پولیمریز پرائمر کے بطور پرائمر یا کاپی کرنے کے لیے مثال کے طور پر استعمال کرتے ہوئے ٹیمپلیٹ اسٹرینڈ کو نقل کرتا ہے۔ پہلے چکر کے نتیجے میں، ہم ایک مخصوص ڈی این اے سیکشن کی متعدد ترتیب وار دوگنا حاصل کرتے ہیں۔ اگلا ہم اس طریقہ کار کو دہراتے ہیں۔ ہر سائیکل کے بعد ہم دوہری مقدار میں ہدف کا علاقہ حاصل کرتے ہیں۔ پچیس PCR سائیکلوں کے بعد (یعنی دو گھنٹے سے بھی کم وقت میں)، ہمارے پاس DNA کا علاقہ ہماری دلچسپی کا اصل سے 225 گنا زیادہ ہے (یعنی ہم نے اسے تقریباً 34 ملین گنا بڑھا دیا ہے)۔ درحقیقت، ان پٹ پر ہمیں پرائمر، ٹیمپلیٹ ڈی این اے، ڈی این اے پولیمریز انزائم اور فری بیسز A، C، G اور T کا ایک مرکب ملا، ایک مخصوص رد عمل کی مصنوعات کی مقدار (پرائمرز کے ذریعے محدود) تیزی سے بڑھتی ہے، اور تعداد "لمبی" ڈی این اے کاپیاں لکیری ہوتی ہیں، اس لیے رد عمل میں مصنوعات کا غلبہ ہوتا ہے۔

مطلوبہ ڈی این اے سیکشن کو بڑھانا: پولیمریز چین ری ایکشن

پی سی آر کے ابتدائی دنوں میں، بنیادی مسئلہ درج ذیل تھا: ہر حرارتی کولنگ سائیکل کے بعد، ڈی این اے پولیمریز کو رد عمل کے مرکب میں شامل کرنا پڑتا تھا، کیونکہ یہ 95 ° C کے درجہ حرارت پر غیر فعال ہو جاتا تھا۔ لہذا، ہر 25 چکروں سے پہلے اسے دوبارہ شامل کرنا ضروری تھا۔ رد عمل کا طریقہ کار نسبتاً غیر موثر تھا، اس میں کافی وقت اور پولیمریز انزائم کی ضرورت تھی، اور مواد بہت مہنگا تھا۔ خوش قسمتی سے، مدر نیچر نے بچایا۔ بہت سے جانور 37 ° C سے کہیں زیادہ درجہ حرارت پر آرام دہ محسوس کرتے ہیں۔ ہمارے لیے 37 ° C کا اعداد و شمار کیوں اہم ہو گیا؟ ایسا اس لیے ہوا کیونکہ یہ درجہ حرارت E. coli کے لیے بہترین ہے، جس سے PCR کے لیے پولیمریز انزائم اصل میں حاصل کیا گیا تھا۔ فطرت میں ایسے مائکروجنزم ہیں جن کے پروٹین، قدرتی انتخاب کے لاکھوں سالوں میں، اعلی درجہ حرارت کے خلاف زیادہ مزاحم ہو گئے ہیں. تھرموفیلک بیکٹیریا سے ڈی این اے پولیمریز استعمال کرنے کی تجویز دی گئی ہے۔ یہ انزائمز تھرموسٹیبل نکلے اور بہت سے رد عمل کے چکروں کو برداشت کرنے کے قابل تھے۔ ان کے استعمال نے پی سی آر کو آسان اور خودکار بنانا ممکن بنایا۔ پہلی تھرموسٹیبل ڈی این اے پولیمریز میں سے ایک بیکٹیریم تھرمس ​​ایکواٹیکس سے الگ تھلگ کیا گیا تھا، جو یلو اسٹون نیشنل پارک کے گرم چشموں میں رہتا ہے، اور اس کا نام Taq پولیمریز رکھا گیا تھا۔

پی سی آر تیزی سے ہیومن جینوم پروجیکٹ کا ورک ہارس بن گیا۔ عام طور پر، یہ عمل ملیس کے تیار کردہ سے مختلف نہیں ہے، یہ ابھی خود کار طریقے سے ہوا ہے۔ اب ہم مدھم گریجویٹ طلباء کے ہجوم پر انحصار نہیں کر رہے تھے جو بڑی محنت سے پلاسٹک کی ٹیسٹ ٹیوبوں میں مائع کی بوندیں ڈال رہے تھے۔ مالیکیولر جینیاتی تحقیق کرنے والی جدید لیبارٹریوں میں یہ کام روبوٹک کنویئرز پر کیا جاتا ہے۔ پی سی آر روبوٹ ہیومن جینوم کی طرح بڑے پیمانے پر ترتیب دینے والے پروجیکٹ میں شامل ہیں جو گرمی سے مستحکم پولیمریز کی بڑی مقدار کے ساتھ مسلسل کام کرتے ہیں۔ ہیومن جینوم پراجیکٹ پر کام کرنے والے کچھ سائنس دان PCR پیٹنٹ کے مالک، یورپی صنعتی دوا ساز کمپنی Hoffmann-LaRoche کی جانب سے استعمال کی جانے والی اشیاء کی قیمتوں میں غیر معقول حد تک زیادہ رائلٹیز سے ناراض تھے۔

ایک اور "ڈرائیونگ اصول" خود ڈی این اے کی ترتیب کا طریقہ تھا۔ اس طریقہ کار کی کیمیائی بنیاد اس وقت نئی نہیں تھی: انٹر اسٹیٹ ہیومن جینوم پروجیکٹ (HGP) نے وہی ذہین طریقہ اپنایا جو فریڈ سینجر نے 1970 کی دہائی کے وسط میں تیار کیا تھا۔ جدت آٹومیشن کے پیمانے اور ڈگری میں تھی جسے تسلسل حاصل کرنے کے قابل تھا۔

خودکار ترتیب کو اصل میں کیلیفورنیا انسٹی ٹیوٹ آف ٹیکنالوجی میں لی ہڈ کی لیبارٹری میں تیار کیا گیا تھا۔ اس نے مونٹانا کے ہائی اسکول میں تعلیم حاصل کی اور کوارٹر بیک کے طور پر کالج فٹ بال کھیلا۔ ہڈ کی بدولت ٹیم نے ایک سے زیادہ مرتبہ ریاستی چیمپئن شپ جیتی۔ ان کی ٹیم ورک کی مہارتیں ان کے سائنسی کیریئر میں بھی کام آئیں۔ ہڈ کی لیبارٹری میں کیمیا دانوں، ماہرین حیاتیات، اور انجینئروں کا عملہ موجود تھا، اور اس کی لیبارٹری جلد ہی تکنیکی جدت طرازی میں ایک رہنما بن گئی۔

درحقیقت خودکار ترتیب کا طریقہ لائیڈ اسمتھ اور مائیک ہنکاپلر نے ایجاد کیا تھا۔ مائیک ہنکاپلر، پھر ہڈ کی لیبارٹری میں کام کر رہے تھے، نے لائیڈ سمتھ سے ایک بہتر ترتیب کے طریقہ کار کی تجویز کے ساتھ رابطہ کیا جس میں ہر قسم کی بنیاد کو مختلف رنگ دیا جائے گا۔ ایسا خیال سنجر کے عمل کی کارکردگی کو چار گنا کر سکتا ہے۔ سینجر میں، جب چار ٹیوبوں میں سے ہر ایک میں ترتیب (اڈوں کی تعداد کے مطابق)، ڈی این اے پولیمریز کی شمولیت سے، مختلف لمبائیوں کے اولیگونوکلیوٹائڈس کا ایک منفرد سیٹ بنتا ہے، جس میں ایک پرائمر ترتیب بھی شامل ہے۔ اس کے بعد، زنجیروں سے علیحدگی کے لیے فارمامائڈ کو ٹیوبوں میں شامل کیا گیا اور پولی کریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس کو چار لین پر انجام دیا گیا۔ اسمتھ اور ہنکاپلر کے ورژن میں، ڈائی آکسینیوکلیوٹائڈس کو چار مختلف رنگوں کے ساتھ لیبل کیا جاتا ہے اور پی سی آر ایک ٹیوب میں انجام دیا جاتا ہے۔ پھر، پولی کریلامائڈ جیل الیکٹروفورسس کے دوران، جیل پر ایک مخصوص جگہ پر ایک لیزر بیم رنگوں کی سرگرمی کو پرجوش کرتی ہے، اور ڈیٹیکٹر اس بات کا تعین کرتا ہے کہ فی الحال جیل کے ذریعے کون سا نیوکلیوٹائڈ منتقل ہو رہا ہے۔ سب سے پہلے، اسمتھ مایوسی کا شکار تھا - اسے خدشہ تھا کہ ڈائی کی انتہائی کم خوراکیں استعمال کرنے سے نیوکلیوٹائڈ علاقوں کو الگ نہیں کیا جا سکتا۔ تاہم، لیزر ٹکنالوجی کی بہترین تفہیم کے ساتھ، اس نے جلد ہی خصوصی فلورو کروم رنگوں کا استعمال کرکے صورتحال سے نکلنے کا راستہ تلاش کیا جو لیزر تابکاری کے سامنے آنے پر فلوریس کرتے ہیں۔

(مکمل ورژن کلک کرکے - 4,08 MB) عمدہ پرنٹ: ڈی این اے کی ترتیب کو ایک خودکار سیکوینسر کا استعمال کرتے ہوئے ترتیب دیا گیا، جو ایک خودکار ترتیب دینے والی مشین سے حاصل کیا گیا ہے۔ ہر رنگ چار اڈوں میں سے ایک سے مساوی ہے۔

سنجر کے طریقہ کار کے کلاسک ورژن میں، تجزیہ شدہ ڈی این اے کے اسٹرینڈز میں سے ایک انزائم ڈی این اے پولیمریز کے ذریعے تکمیلی اسٹرینڈ کی ترکیب کے لیے ٹیمپلیٹ کے طور پر کام کرتا ہے، پھر ڈی این اے کے ٹکڑوں کی ترتیب کو سائز کے لحاظ سے جیل میں ترتیب دیا جاتا ہے۔ ہر ایک ٹکڑا، جو کہ ترکیب کے دوران ڈی این اے میں شامل ہوتا ہے اور بعد میں رد عمل کی مصنوعات کو دیکھنے کی اجازت دیتا ہے، اس پر ٹرمینل بیس کے مطابق فلوروسینٹ رنگ کا لیبل لگایا جاتا ہے (اس پر صفحہ 124 پر تبادلہ خیال کیا گیا تھا)؛ لہذا، اس ٹکڑے کا فلوروسینس دی گئی بنیاد کے لیے ایک شناخت کنندہ ہوگا۔ پھر جو کچھ باقی رہ جاتا ہے وہ ہے پتہ لگانے اور رد عمل کی مصنوعات کا تصور کرنا۔ نتائج کا تجزیہ کمپیوٹر کے ذریعے کیا جاتا ہے اور انہیں چار نیوکلیوٹائڈس کے مساوی کثیر رنگی چوٹیوں کی ترتیب کے طور پر پیش کیا جاتا ہے۔ اس کے بعد معلومات کو براہ راست کمپیوٹر کے انفارمیشن سسٹم میں منتقل کیا جاتا ہے، جس سے وقت طلب اور بعض اوقات تکلیف دہ ڈیٹا انٹری کے عمل کو ختم کیا جاتا ہے جس نے ترتیب کو بہت مشکل بنا دیا تھا۔

»کتاب کے بارے میں مزید تفصیلات یہاں پر دیکھی جا سکتی ہیں۔ پبلشر کی ویب سائٹ
» مواد کی میز
» اقتباس

Khabrozhiteley کے لیے کوپن کا استعمال کرتے ہوئے 25% ڈسکاؤنٹ - پی سی آر

ماخذ: www.habr.com