Người Mỹ đoạt giải Nobel về hóa học Kary Mullis qua đời ở California ở tuổi 74. Theo vợ ông, cái chết xảy ra vào ngày 7 tháng XNUMX. Nguyên nhân là do suy tim và hô hấp do viêm phổi.
Chính James Watson, người phát hiện ra phân tử DNA, sẽ cho chúng ta biết về những đóng góp của ông cho lĩnh vực hóa sinh và nhờ đó ông đã nhận được giải thưởng Nobel.
Trích từ cuốn sách của James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
ADN. Lịch sử của cuộc cách mạng di truyền
Chương 7. Bộ gen của con người. Kịch bản cuộc sống
...
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được phát minh vào năm 1983 bởi nhà hóa sinh Carey Mullis, người làm việc tại Cetus. Việc phát hiện ra phản ứng này khá đáng chú ý. Mullis sau này nhớ lại: “Một tối thứ sáu tháng 1983 năm 1993, tôi được hiển linh. Tôi đã cầm lái, lái xe trên con đường núi quanh co đầy ánh trăng ở Bắc California, xứ sở của những cánh rừng gỗ đỏ.” Điều ấn tượng là chính trong hoàn cảnh như vậy, nguồn cảm hứng đã đến với anh. Và không phải miền bắc California có những con đường đặc biệt thúc đẩy sự hiểu biết sâu sắc; chỉ là bạn của anh ấy đã từng nhìn thấy Mullis phóng nhanh một cách liều lĩnh dọc theo một con đường đôi đầy băng giá và điều đó không làm anh ấy bận tâm chút nào. Một người bạn nói với tờ New York Times: “Mullis đã tưởng tượng rằng anh ấy sẽ chết nếu đâm vào một cây gỗ đỏ. Vì vậy, anh ấy không sợ bất cứ điều gì khi lái xe, trừ khi có những cây gỗ đỏ mọc ven đường ”. Sự hiện diện của những cây gỗ đỏ dọc đường đã buộc Mullis phải tập trung và... đây rồi, một cái nhìn sâu sắc. Mullis đã nhận được giải thưởng Nobel về hóa học cho phát minh của mình vào năm XNUMX và kể từ đó, hành động của ông thậm chí còn trở nên kỳ lạ hơn. Ví dụ, ông là người ủng hộ lý thuyết xét lại rằng AIDS không liên quan đến HIV, điều này đã làm suy yếu đáng kể danh tiếng của ông và gây trở ngại cho các bác sĩ.
PCR là một phản ứng khá đơn giản. Để thực hiện nó, chúng ta cần hai đoạn mồi được tổng hợp về mặt hóa học bổ sung cho các đầu đối diện của các chuỗi khác nhau của đoạn DNA cần thiết. Mồi là những đoạn DNA mạch đơn ngắn, mỗi đoạn dài khoảng 20 cặp bazơ. Điểm đặc biệt của mồi là chúng tương ứng với các đoạn DNA cần khuếch đại, đó là mẫu DNA.
(Có thể nhấp vào hình ảnh) Kary Mullis, người phát minh ra PCR
Tính đặc hiệu của PCR dựa trên sự hình thành các phức hợp bổ sung giữa khuôn và mồi, các oligonucleotide tổng hợp ngắn. Mỗi đoạn mồi bổ sung cho một trong các sợi của mẫu sợi đôi và giới hạn điểm bắt đầu và điểm kết thúc của vùng khuếch đại. Trên thực tế, “ma trận” thu được là toàn bộ bộ gen và mục tiêu của chúng tôi là tách biệt các phần mà chúng tôi quan tâm khỏi nó. Để làm điều này, mẫu DNA sợi đôi được làm nóng đến 95°C trong vài phút để tách các sợi DNA. Giai đoạn này được gọi là biến tính vì liên kết hydro giữa hai chuỗi DNA bị phá vỡ. Khi các sợi đã tách ra, nhiệt độ sẽ được hạ xuống để cho phép các mồi liên kết với mẫu sợi đơn. DNA polymerase bắt đầu sao chép DNA bằng cách liên kết với một chuỗi nucleotide. Enzym DNA polymerase sao chép chuỗi mẫu bằng cách sử dụng mồi làm mồi hoặc ví dụ để sao chép. Kết quả của chu kỳ đầu tiên là chúng ta thu được nhiều lần nhân đôi tuần tự của một đoạn DNA nhất định. Tiếp theo chúng tôi lặp lại thủ tục này. Sau mỗi chu kỳ, chúng tôi thu được diện tích mục tiêu với số lượng gấp đôi. Sau 225 chu kỳ PCR (tức là trong vòng chưa đầy hai giờ), chúng tôi có được vùng DNA mà chúng tôi quan tâm với số lượng cao gấp 34 lần so với ban đầu (nghĩa là chúng tôi đã khuếch đại nó khoảng XNUMX triệu lần). Trên thực tế, ở đầu vào, chúng tôi nhận được hỗn hợp mồi, DNA mẫu, enzyme DNA polymerase và bazơ tự do A, C, G và T, lượng sản phẩm phản ứng cụ thể (được giới hạn bởi mồi) tăng theo cấp số nhân và số lượng của các bản sao DNA “dài” là tuyến tính, vì vậy sản phẩm phản ứng chiếm ưu thế.
Khuếch đại đoạn DNA mong muốn: Phản ứng chuỗi polymerase
Trong những ngày đầu của PCR, vấn đề chính là sau: sau mỗi chu kỳ làm nóng-làm mát, DNA polymerase phải được thêm vào hỗn hợp phản ứng vì nó bị bất hoạt ở nhiệt độ 95 ° C. Vì vậy, cần phải thêm lại nó trước mỗi chu kỳ trong số 25 chu kỳ. Quy trình phản ứng tương đối kém hiệu quả, đòi hỏi nhiều thời gian và enzyme polymerase, đồng thời vật liệu rất đắt tiền. May mắn thay, mẹ thiên nhiên đã đến giải cứu. Nhiều loài động vật cảm thấy thoải mái ở nhiệt độ cao hơn nhiều so với 37°C. Tại sao con số 37°C lại trở nên quan trọng đối với chúng ta? Điều này xảy ra vì nhiệt độ này là tối ưu cho E. coli, từ đó ban đầu thu được enzyme polymerase cho PCR. Trong tự nhiên, có những vi sinh vật có protein, qua hàng triệu năm chọn lọc tự nhiên, đã trở nên bền hơn với nhiệt độ cao. Người ta đã đề xuất sử dụng DNA polymerase từ vi khuẩn ưa nhiệt. Những enzyme này hóa ra có khả năng chịu nhiệt và có thể chịu được nhiều chu kỳ phản ứng. Việc sử dụng chúng giúp đơn giản hóa và tự động hóa PCR. Một trong những DNA polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập từ vi khuẩn Thermus Aquas, sống ở suối nước nóng của Công viên Quốc gia Yellowstone, và được đặt tên là Taq polymerase.
PCR nhanh chóng trở thành công cụ chính của Dự án Bộ gen Người. Nhìn chung, quy trình này không khác gì quy trình do Mullis phát triển, nó vừa được tự động hóa. Chúng tôi không còn phụ thuộc vào đám đông sinh viên tốt nghiệp ngu dốt đang tỉ mỉ đổ từng giọt chất lỏng vào ống nghiệm bằng nhựa. Trong các phòng thí nghiệm hiện đại thực hiện nghiên cứu di truyền phân tử, công việc này được thực hiện trên băng tải robot. Các robot PCR tham gia vào dự án giải trình tự quy mô lớn như Bộ gen người làm việc không ngừng nghỉ với khối lượng lớn polymerase ổn định nhiệt. Một số nhà khoa học làm việc trong Dự án Bộ gen Người đã tỏ ra phẫn nộ trước khoản tiền bản quyền cao bất hợp lý được chủ sở hữu bằng sáng chế PCR, gã khổng lồ dược phẩm công nghiệp Châu Âu Hoffmann-LaRoche cộng thêm vào chi phí vật tư tiêu hao.
Một “nguyên tắc định hướng” khác chính là phương pháp giải trình tự DNA. Cơ sở hóa học của phương pháp này không còn mới vào thời điểm đó: Dự án bộ gen người liên bang (HGP) đã áp dụng cùng một phương pháp khéo léo mà Fred Sanger đã phát triển vào giữa những năm 1970. Sự đổi mới nằm ở quy mô và mức độ tự động hóa mà trình tự có thể đạt được.
Trình tự tự động ban đầu được phát triển trong phòng thí nghiệm của Lee Hood tại Viện Công nghệ California. Anh ấy học trung học ở Montana và chơi bóng đá ở trường đại học ở vị trí tiền vệ; Nhờ có Hood, đội đã hơn một lần giành được chức vô địch bang. Kỹ năng làm việc nhóm của ông cũng có ích trong sự nghiệp khoa học của ông. Phòng thí nghiệm của Hood có đội ngũ nhân viên đa dạng gồm các nhà hóa học, nhà sinh học và kỹ sư, và phòng thí nghiệm của ông nhanh chóng trở thành phòng thí nghiệm đi đầu trong đổi mới công nghệ.
Trên thực tế, phương pháp giải trình tự tự động được phát minh bởi Lloyd Smith và Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, khi đó đang làm việc trong phòng thí nghiệm của Hood, đã tiếp cận Lloyd Smith với đề xuất về một phương pháp giải trình tự cải tiến, trong đó mỗi loại bazơ sẽ có màu khác nhau. Ý tưởng như vậy có thể tăng gấp bốn lần hiệu quả của quy trình Sanger. Trong Sanger, khi giải trình tự trong mỗi ống trong số bốn ống (theo số lượng bazơ), với sự tham gia của DNA polymerase, một bộ oligonucleotide duy nhất có độ dài khác nhau sẽ được hình thành, bao gồm cả trình tự mồi. Tiếp theo, formamide được thêm vào các ống để tách chuỗi và điện di trên gel polyacrylamide được thực hiện trên bốn làn. Trong phiên bản của Smith và Hunkapiller, các dideoxynucleotide được dán nhãn bằng bốn loại thuốc nhuộm khác nhau và PCR được thực hiện trong một ống. Sau đó, trong quá trình điện di trên gel polyacrylamide, một chùm tia laser tại một vị trí cụ thể trên gel sẽ kích thích hoạt động của thuốc nhuộm và máy dò xác định nucleotide nào hiện đang di chuyển qua gel. Lúc đầu, Smith tỏ ra bi quan - ông sợ rằng việc sử dụng liều lượng thuốc nhuộm cực thấp sẽ dẫn đến việc không thể phân biệt được các vùng nucleotide. Tuy nhiên, với sự hiểu biết sâu sắc về công nghệ laser, anh đã sớm tìm ra cách thoát khỏi tình trạng này bằng cách sử dụng thuốc nhuộm fluorochrome đặc biệt phát huỳnh quang khi tiếp xúc với bức xạ laser.
(Phiên bản đầy đủ - 4,08 MB) Bản in đẹp: Trình tự DNA được giải trình tự bằng máy giải trình tự tự động, thu được từ máy giải trình tự tự động. Mỗi màu tương ứng với một trong bốn căn cứ
Trong phiên bản cổ điển của phương pháp Sanger, một trong các chuỗi DNA được phân tích đóng vai trò là khuôn mẫu để tổng hợp chuỗi bổ sung bằng enzyme DNA polymerase, sau đó trình tự các đoạn DNA được sắp xếp trong gel theo kích thước. Mỗi đoạn DNA được đưa vào trong quá trình tổng hợp và cho phép hình dung các sản phẩm phản ứng sau đó được dán nhãn bằng thuốc nhuộm huỳnh quang tương ứng với gốc cuối cùng (điều này đã được thảo luận ở trang 124); do đó, huỳnh quang của mảnh này sẽ là dấu hiệu nhận biết cho một bazơ nhất định. Sau đó, tất cả những gì còn lại là thực hiện phát hiện và hình dung các sản phẩm phản ứng. Kết quả được phân tích bằng máy tính và trình bày dưới dạng chuỗi các pic nhiều màu tương ứng với XNUMX nucleotide. Thông tin sau đó được chuyển trực tiếp đến hệ thống thông tin của máy tính, loại bỏ quá trình nhập dữ liệu tốn thời gian và đôi khi gây khó khăn khiến việc sắp xếp dữ liệu trở nên rất khó khăn.
» Thông tin chi tiết về cuốn sách có thể tìm thấy tại
»
»
Đối với Khabrozhiteley giảm giá 25% khi sử dụng phiếu giảm giá - PCR
Nguồn: www.habr.com