Ebun Nobel ninu kemistri Kary Mullis ku ni California ni ẹni ọdun 74. Gẹgẹbi iyawo rẹ, iku waye ni Oṣu Kẹjọ ọjọ 7. Idi ni ọkan ati ikuna atẹgun nitori pneumonia.
James Watson tikararẹ, oluṣawari ti DNA moleku, yoo sọ fun wa nipa ilowosi rẹ si biochemistry ati fun eyiti o gba Ebun Nobel.
Yiyọ lati inu iwe nipasẹ James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Itan ti Jiini Iyika
Chapter 7. eda eniyan genome. Aye igbesi aye
...
Idahun pipọ polymerase (PCR) ni a ṣẹda ni ọdun 1983 nipasẹ onimọ-jinlẹ Carey Mullis, ti o ṣiṣẹ ni Cetus. Awari ti yi lenu je ohun o lapẹẹrẹ. Mullis rántí lẹ́yìn náà pé: “Ní ìrọ̀lẹ́ ọjọ́ Friday kan ní April 1983, mo ní ìpayà. Mo wà lẹ́yìn kẹ̀kẹ́ náà, mo ń wakọ̀ lọ́nà òṣùpá kan, tó ń yípo ní Àríwá California, ilẹ̀ àwọn igbó Redwood.” O jẹ iwunilori pe o wa ni iru ipo bẹẹ ti awokose kọlu u. Ati pe kii ṣe pe ariwa California ni awọn ọna pataki ti o ṣe igbelaruge imọran; Ó kàn jẹ́ pé ọ̀rẹ́ rẹ̀ rí Mullis tí ó ń yára kánkán láìbìkítà lẹ́gbẹ̀ẹ́ ojú ọ̀nà ọkọ̀ ẹlẹ́rìndòdò yinyin kan tí kò sì yọ ọ́ lẹ́nu rárá. Ọrẹ kan sọ fun New York Times pe: “Mullis ni iran kan pe oun yoo ku nipa fifọ lu igi pupa kan. Nitorinaa, ko bẹru ohunkohun lakoko iwakọ, ayafi ti awọn igi pupa ti n dagba ni opopona.” Iwaju ti redwoods ni opopona fi agbara mu Mullis lati ṣojumọ ati ... nibi o jẹ, oye kan. Mullis gba Ebun Nobel ninu Kemistri fun ẹda rẹ ni ọdun 1993 ati pe o ti di alejò paapaa ninu awọn iṣe rẹ. Fún àpẹẹrẹ, ó jẹ́ olùrànlọ́wọ́ ti àbá èrò orí àtúnyẹ̀wò náà pé AIDS kò ní í ṣe pẹ̀lú HIV, èyí tí ó ba orúkọ ara rẹ̀ jẹ́ ní pàtàkì, tí ó sì ba àwọn dókítà lọ́wọ́.
PCR jẹ idahun ti o rọrun. Lati ṣe e, a nilo awọn alakoko kemika meji ti a ṣepọ ti o jẹ ibamu si awọn opin idakeji ti awọn oriṣiriṣi oriṣiriṣi ti ajẹkù DNA ti a beere. Awọn alakoko jẹ awọn apakan kukuru ti DNA ti o ni ẹyọkan, ọkọọkan nipa awọn orisii ipilẹ 20 ni gigun. Iyatọ ti awọn alakoko ni pe wọn ṣe deede si awọn abala DNA ti o nilo lati ṣe alekun, iyẹn ni, awoṣe DNA.
(Aworan clickable) Kary Mullis, onihumọ ti PCR
Ni pato ti PCR da lori dida awọn eka ibaramu laarin awoṣe ati awọn alakoko, oligonucleotides sintetiki kukuru. Olukuluku alakoko jẹ ibaramu si ọkan ninu awọn okun ti awoṣe ti o ni ilopo meji ati pe o fi opin si ibẹrẹ ati opin agbegbe ti imudara. Ni otitọ, “matrix” ti o yọrisi jẹ gbogbo jiini, ati ibi-afẹde wa ni lati ya sọtọ awọn ajẹkù ti iwulo si wa lati inu rẹ. Lati ṣe eyi, awoṣe DNA ti o ni ilọpo meji jẹ kikan si 95 °C fun awọn iṣẹju pupọ lati ya awọn okun DNA. Ipele yii ni a npe ni denaturation nitori awọn asopọ hydrogen laarin awọn okun DNA meji ti bajẹ. Ni kete ti awọn okun ba ti yapa, iwọn otutu ti lọ silẹ lati jẹ ki awọn alakoko le so mọ awoṣe ti o ni okun kan. DNA polymerase bẹrẹ ẹda DNA nipa sisọ si isan ti pq nucleotide. Enzymu DNA polymerase ṣe atunṣe okun awoṣe nipa lilo alakoko bi alakoko tabi apẹẹrẹ fun didakọ. Bi abajade ti akọkọ ọmọ, a gba ọpọ lesese lemeji ti kan awọn DNA apakan. Nigbamii a tun ilana yii ṣe. Lẹhin iyipo kọọkan a gba agbegbe ibi-afẹde ni iye meji. Lẹhin awọn iyipo PCR marundinlọgbọn (iyẹn ni, ni o kere ju wakati meji lọ), a ni agbegbe DNA ti iwulo si wa ni iye 225 ti o ga ju atilẹba lọ (iyẹn ni, a ti pọ si ni isunmọ awọn akoko miliọnu 34). Ni otitọ, ni titẹ sii a gba adalu awọn alakoko, DNA awoṣe, enzymu DNA polymerase ati awọn ipilẹ ọfẹ A, C, G ati T, iye ọja ifasẹ kan pato (ipin nipasẹ awọn alakoko) dagba ni afikun, ati nọmba naa. ti awọn ẹda DNA “gun” jẹ laini, nitorinaa ninu awọn ọja ifaseyin jẹ gaba lori.
Imudara ti apakan DNA ti o fẹ: iṣesi pq polymerase
Ni awọn ọjọ ibẹrẹ ti PCR, iṣoro akọkọ ni atẹle yii: lẹhin iwọn otutu itutu agbaiye kọọkan, DNA polymerase ni lati ṣafikun si adalu ifaseyin, niwọn bi a ti mu ṣiṣẹ ni iwọn otutu ti 95 ° C. Nitorinaa, o jẹ dandan lati tun-fi kun ṣaaju ọkọọkan awọn iyipo 25 naa. Ilana ifasẹyin jẹ ailagbara, o nilo akoko pupọ ati henensiamu polymerase, ati pe ohun elo naa jẹ gbowolori pupọ. Ni Oriire, Iya Iseda wa si igbala. Ọpọlọpọ awọn ẹranko ni itunu ni awọn iwọn otutu ti o ga ju 37 °C. Kini idi ti nọmba 37 °C ṣe pataki fun wa? Eyi ṣẹlẹ nitori iwọn otutu yii dara julọ fun E. coli, lati inu eyiti a ti gba enzymu polymerase fun PCR ni akọkọ. Ninu iseda awọn microorganisms wa ti awọn ọlọjẹ, ni awọn miliọnu ọdun ti yiyan adayeba, ti di sooro diẹ sii si awọn iwọn otutu giga. O ti dabaa lati lo awọn polymerases DNA lati awọn kokoro arun thermophilic. Awọn ensaemusi wọnyi yipada lati jẹ thermostable ati pe wọn ni anfani lati koju ọpọlọpọ awọn akoko ifasẹyin. Lilo wọn jẹ ki o ṣee ṣe lati rọrun ati adaṣe PCR. Ọkan ninu awọn polymerases DNA thermostable akọkọ ti ya sọtọ lati kokoro-arun Thermus aquaticus, eyiti o ngbe ni awọn orisun gbigbona ti Egan Orilẹ-ede Yellowstone, ati pe orukọ rẹ ni Taq polymerase.
PCR ni kiakia di awọn workhorse ti Human Genome Project. Ni gbogbogbo, ilana naa ko yatọ si eyiti o dagbasoke nipasẹ Mullis, o ṣẹṣẹ jẹ adaṣe. A ko gbẹkẹle ogunlọgọ ti awọn ọmọ ile-iwe giga ti ko ni oye ni itara ti n da awọn isun omi omi sinu awọn ọpọn idanwo ṣiṣu. Ni awọn ile-iṣere ode oni ti n ṣe iwadii jiini molikula, iṣẹ yii ni a ṣe lori awọn ẹrọ gbigbe roboti. Awọn roboti PCR ti o ni ipa ninu iṣẹ akanṣe kan ti o tobi bi Jiini Eniyan ti n ṣiṣẹ lainidi pẹlu awọn iwọn nla ti polymerase-iduroṣinṣin ooru. Diẹ ninu awọn onimo ijinlẹ sayensi ti n ṣiṣẹ lori Ise agbese Genome Eniyan ni ibinu nipasẹ awọn owo-ori giga ti ko ni ironu ti a ṣafikun si idiyele awọn ohun elo nipasẹ oniwun itọsi PCR, omiran elegbogi ile-iṣẹ Yuroopu Hoffmann-LaRoche.
“Ipilẹṣẹ awakọ” miiran ni ọna tito lẹsẹsẹ DNA funrararẹ. Ipilẹ kemikali ti ọna yii kii ṣe tuntun mọ ni akoko yẹn: Interstate Human Genome Project (HGP) gba ọna ọgbọn kanna ti Fred Sanger ti ni idagbasoke pada ni aarin awọn ọdun 1970. Awọn ĭdàsĭlẹ dubulẹ ni asekale ati ìyí ti adaṣiṣẹ ti sequencing je anfani lati se aseyori.
Ilana adaṣe adaṣe ni akọkọ ni idagbasoke ni ile-iyẹwu Lee Hood ni Ile-ẹkọ Imọ-ẹrọ California. O lọ si ile-iwe giga ni Montana ati pe o ṣe bọọlu kọlẹji bii mẹẹdogun; Ṣeun si Hood, ẹgbẹ naa ṣẹgun aṣaju ipinle diẹ sii ju ẹẹkan lọ. Awọn ọgbọn iṣẹ ẹgbẹ rẹ tun wa ni ọwọ ninu iṣẹ imọ-jinlẹ rẹ. Ile-iyẹwu Hood jẹ oṣiṣẹ nipasẹ awọn atukọ motley ti awọn kemists, awọn onimọ-jinlẹ, ati awọn onimọ-ẹrọ, ati pe laipẹ yàrá rẹ di aṣaaju ninu isọdọtun imọ-ẹrọ.
Ni otitọ, ọna ṣiṣe adaṣe adaṣe jẹ idasilẹ nipasẹ Lloyd Smith ati Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, lẹhinna ṣiṣẹ ni yàrá Hood, sunmọ Lloyd Smith pẹlu imọran fun ọna imudara ilọsiwaju ninu eyiti iru ipilẹ kọọkan yoo jẹ awọ yatọ. Iru ero yii le ṣe idamẹrin ṣiṣe ti ilana Sanger. Ni Sanger, nigbati o ba ṣe ilana ni ọkọọkan awọn tubes mẹrin (gẹgẹbi nọmba awọn ipilẹ), pẹlu ikopa ti DNA polymerase, ṣeto oto ti oligonucleotides ti awọn gigun ti o yatọ ni a ṣẹda, pẹlu ilana alakoko kan. Nigbamii ti, a ṣe afikun formamide si awọn tubes fun iyapa pq ati polyacrylamide gel electrophoresis ti ṣe lori awọn ọna mẹrin. Ninu ẹya Smith ati Hunkapiller, dideoxynucleotides jẹ aami pẹlu awọn awọ oriṣiriṣi mẹrin ati PCR ni a ṣe ni tube kan. Lẹhinna, lakoko polyacrylamide gel electrophoresis, ina ina lesa ni ipo kan pato lori gel ṣe itara iṣẹ ṣiṣe ti awọn awọ, ati oluwari pinnu iru nucleotide ti n lọ lọwọlọwọ nipasẹ gel. Ni akọkọ, Smith ko ni ireti - o bẹru pe lilo awọn iwọn kekere ti awọ yoo yorisi awọn agbegbe nucleotide ti ko ṣe iyatọ. Sibẹsibẹ, nini oye ti o dara julọ ti imọ-ẹrọ laser, laipẹ o wa ọna kan kuro ninu ipo naa nipa lilo awọn awọ fluorochrome pataki ti o tan imọlẹ nigbati o farahan si itankalẹ laser.
(Ẹya ni kikun - 4,08 MB) Titẹjade ti o dara: Atẹle DNA ti o tẹle nipa lilo oluṣeto adaṣe adaṣe, ti a gba lati inu ẹrọ ṣiṣe adaṣe adaṣe. Awọ kọọkan ni ibamu si ọkan ninu awọn ipilẹ mẹrin
Ninu ẹya Ayebaye ti ọna Sanger, ọkan ninu awọn okun ti DNA ti a ṣe atupale ṣe bi awoṣe fun iṣelọpọ ti okun ibaramu nipasẹ enzyme DNA polymerase, lẹhinna ọkọọkan awọn ajẹkù DNA jẹ lẹsẹsẹ ni jeli nipasẹ iwọn. Ajeku kọọkan, eyiti o wa ninu DNA lakoko iṣelọpọ ati gba iwoye atẹle ti awọn ọja ifaseyin, jẹ aami pẹlu awọ Fuluorisenti ti o baamu si ipilẹ ebute (eyi ti jiroro lori p. 124); nitorina, fluorescence ti ajẹkù yii yoo jẹ idanimọ fun ipilẹ ti a fun. Lẹhinna gbogbo ohun ti o ku ni lati ṣe wiwa ati foju inu wo awọn ọja ifaseyin. Awọn abajade ti wa ni atupale nipasẹ kọnputa ati gbekalẹ bi ọna ti awọn oke giga ti awọ-pupọ ti o baamu si awọn nucleotides mẹrin. Lẹhinna a gbe alaye naa taara si eto alaye kọnputa, imukuro akoko-n gba ati ilana titẹsi data ti o ni irora nigbakan ti o jẹ ki ṣiṣe atẹle le nira pupọ.
» Awọn alaye diẹ sii nipa iwe le ṣee ri ni
»
»
Fun Khabrozhiteley 25% ẹdinwo nipa lilo kupọọnu - PCR
orisun: www.habr.com