美國諾貝爾化學獎得主卡里·穆利斯在加州去世，享年 74 歲。 據他的妻子稱，死亡發生於7月XNUMX日。 原因是肺炎引起的心臟和呼吸衰竭。
DNA 分子的發現者詹姆斯·沃森本人將向我們講述他對生物化學的貢獻並因此獲得諾貝爾獎。
摘自詹姆斯·沃森、安德魯·貝裡、凱文·戴維斯所寫的書
脫氧核糖核酸。 基因革命的歷史
第 7 章人類基因組。 生活場景
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聚合酶鍊式反應 (PCR) 是由在 Cetus 工作的生物化學家 Carey Mullis 於 1983 年發明的。 這個反應的發現是相當了不起的。 穆利斯後來回憶道：「1983 年 1993 月的一個星期五晚上，我頓悟了。 我坐在方向盤後面，沿著月光下、蜿蜒的山路行駛在北加州紅杉林的土地上。” 令人印象深刻的是，他就是在這樣的情況下獲得了靈感。 這並不是說北加州有特殊的道路可以促進洞察力；而是因為北加州有特殊的道路可以促進洞察力。 只是他的朋友曾經看到穆利斯在結冰的雙車道上魯莽地超速行駛，但他對此一點也不介意。 一位朋友告訴《紐約時報》：「穆利斯有個幻象，他會撞到一棵紅杉樹而死。 所以，他開車時什麼都不怕，除非路邊長著紅杉樹。” 路邊的紅杉樹迫使穆利斯集中註意力……這就是一個洞見。 穆利斯因其發明於 XNUMX 年獲得諾貝爾化學獎，此後他的行為變得更加奇怪。 例如，他是愛滋病與愛滋病毒無關的修正主義理論的支持者，這極大地損害了他自己的聲譽並幹擾了醫生。
PCR 是一個相當簡單的反應。 為了實現這一點，我們需要兩個化學合成的引物，它們與所需 DNA 片段不同鏈的相對末端互補。 引子是單股 DNA 的短片段，每條長度約 20 個鹼基對。 引子的特殊之處在於它們對應於需要擴增的DNA片段，即DNA模板。
（圖片可點擊）Kary Mullis，PCR 發明者
PCR 的特異性是基於模板和引子（短的合成寡核苷酸）之間形成的互補複合物。 每個引子與雙股模板的一條鏈互補，並限制擴增區域的開始和結束。 事實上，由此產生的「矩陣」是整個基因組，我們的目標是從中分離出我們感興趣的片段。 為此，將雙股 DNA 模板加熱至 95 °C 幾分鐘以分離 DNA 鏈。 這個階段稱為變性，因為兩條 DNA 鏈之間的氫鍵被破壞。 一旦鏈分離，就降低溫度以使引子與單鏈模板結合。 DNA 聚合酶透過與一段核苷酸鏈結合開始 DNA 複製。 DNA聚合酶使用引子作為複製的引子或範例來複製模板鏈。 第一個循環的結果是，我們得到了某個 DNA 片段的多次連續加倍。 接下來我們重複這個過程。 每個週期後，我們都會獲得雙倍數量的目標區域。 經過 225 個 PCR 循環（即不到兩小時），我們感興趣的 DNA 區域的數量比原始區域高 34 倍（即我們將其擴增了大約 XNUMX 萬倍）。 事實上，在輸入時，我們收到了引子、模板DNA、DNA 聚合酶和遊離鹼基A、C、G 和T 的混合物，特定反應產物的量（受引子限制）呈指數增長，並且數量呈指數增長。 “長”DNA 拷貝的數量是線性的，因此反應產物占主導地位。
所需 DNA 片段的擴增：聚合酶鍊式反應
在 PCR 的早期，主要問題如下：在每次加熱-冷卻循環後，必須將 DNA 聚合酶添加到反應混合物中，因為它在 95°C 的溫度下會失去活性。 因此，有必要在25個循環之前重新添加。 反應過程效率相對較低，需要大量的時間和聚合酶，而且材料非常昂貴。 幸運的是，大自然母親來救援了。 許多動物在遠高於 37°C 的溫度下會感到舒適。 為什麼 37°C 這個數字對我們來說變得很重要？ 發生這種情況是因為這個溫度對大腸桿菌來說是最佳溫度，而 PCR 聚合酶最初是從大腸桿菌中獲得的。 自然界中存在一些微生物，其蛋白質經過數百萬年的自然選擇，變得更耐高溫。 有人建議使用嗜熱細菌的DNA聚合酶。 這些酶被證明是熱穩定的，能夠承受許多反應週期。 它們的使用使得 PCR 的簡化和自動化成為可能。 第一個耐熱 DNA 聚合酶是從生活在黃石國家公園溫泉中的棲熱菌細菌中分離出來的，被命名為 Taq 聚合酶。
PCR 很快就成為人類基因組計畫的主力。 總的來說，這個過程與穆利斯開發的過程沒有什麼不同，只是實現了自動化。 我們不再依賴一群愚蠢的研究生辛苦地將液滴倒入塑膠試管中。 在進行分子遺傳學研究的現代實驗室中，這項工作是在機器人傳送帶上進行的。 參與人類基因組這樣規模的定序計畫的 PCR 機器人不斷地使用大量熱穩定聚合酶。 一些從事人類基因組計畫的科學家對 PCR 專利所有者、歐洲工業製藥巨頭霍夫曼-拉羅氏公司在消耗品成本上增加的不合理的高額特許權使用費感到憤怒。
另一個「驅動原理」是 DNA 定序方法本身。 這種方法的化學基礎在當時已不再新鮮：州際人類基因組計畫 (HGP) 採用了 Fred Sanger 在 1970 世紀 XNUMX 年代中期開發的相同巧妙方法。 創新在於定序能夠實現的自動化規模和程度。
自動定序最初是在加州理工學院的 Lee Hood 實驗室開發的。 他在蒙大拿州上高中，並在大學擔任四分衛。 感謝胡德，球隊不只一次獲得州冠軍。 他的團隊合作能力在他的科學生涯中也派上了用場。 胡德的實驗室由化學家、生物學家和工程師組成，他的實驗室很快就成為技術創新的領導者。
事實上，自動定序方法是由 Lloyd Smith 和 Mike Hunkapiller 發明的。 當時在胡德實驗室工作的 Mike Hunkapiller 向勞埃德·史密斯提出了一項改進測序方法的建議，其中每種類型的鹼基都會有不同的顏色。 這樣的想法可以使桑格過程的效率提高四倍。 在Sanger中，當在四個試管中的每一個中進行定序時（根據鹼基數量），在DNA聚合酶的參與下，形成一組獨特的不同長度的寡核苷酸，包括引子序列。 接下來，在管中加入甲醯胺進行鏈分離，並在四個泳道上進行聚丙烯醯胺凝膠電泳。 在 Smith 和 Hunkapiller 的版本中，雙脫氧核苷酸以四種不同的染料標記，並且 PCR 在一根管中進行。 然後，在聚丙烯酰胺凝膠電泳過程中，凝膠上特定位置的雷射光束激發染料的活性，檢測器確定目前正在凝膠中遷移的核苷酸。 起初，史密斯很悲觀——他擔心使用超低劑量的染料會導致核苷酸區域無法區分。 然而，由於對雷射技術有深入的了解，他很快就找到了擺脫這種情況的方法，即使用特殊的螢光染料，這種染料在受到雷射輻射時會發出螢光。
（完整版 - 4,08 MB) 小字：使用自動定序儀定序的 DNA 序列，從自動定序機取得。 每種顏色對應四種鹼基之一
在桑格方法的經典版本中，所分析的 DNA 的一條鏈充當 DNA 聚合酶合成互補鏈的模板，然後在凝膠中按大小對 DNA 片段的序列進行排序。 每個片段在合成過程中包含在 DNA 中，並允許隨後可視化反應產物，並用與末端鹼基相對應的螢光染料進行標記（這已在第 124 頁討論過）； 因此，該片段的螢光將是給定鹼基的識別碼。 然後剩下的就是進行檢測並視覺化反應產物。 結果透過電腦進行分析並呈現為對應於四個核苷酸的多色峰序列。 然後，資訊將直接傳輸到電腦的資訊系統，從而消除了耗時且有時令人痛苦的資料輸入過程，該過程使排序變得非常困難。
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來源： www.habr.com