Il-Premju Nobel Amerikan fil-kimika Kary Mullis mietet f’Kalifornja fl-età ta’ 74 sena. Skont martu, il-mewt seħħet fis-7 ta’ Awwissu. Il-kawża hija insuffiċjenza tal-qalb u respiratorja minħabba pnewmonja.
James Watson innifsu, dak li jiskopri l-molekula tad-DNA, se jgħidilna dwar il-kontribut tiegħu għall-bijokimika u li għalih irċieva l-Premju Nobel.
Silta mill-ktieb ta' James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Storja tar-Rivoluzzjoni Ġenetika
Kapitolu 7. Ġenoma uman. Xenarju tal-ħajja
...
Ir-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR) ġiet ivvintata fl-1983 mill-bijokimika Carey Mullis, li ħadem fuq Cetus. L-iskoperta ta 'din ir-reazzjoni kienet pjuttost notevoli. Iktar tard Mullis fakkar: “Wieħed il-Ġimgħa filgħaxija f’April 1983, kelli epifanija. Jien kont wara r-rota, insuq ’l isfel minn triq tal-muntanji mdawra bil-qamar u mdawra fit-Tramuntana tal-Kalifornja, l-art tal-foresti Redwood.” Huwa impressjonanti li kien f'sitwazzjoni bħal din li l-ispirazzjoni laqtitu. U mhuwiex li t-tramuntana ta 'Kalifornja għandha toroq speċjali li jippromwovu l-għarfien; huwa biss li ħabib tiegħu darba ra lil Mullis iħaffef bi traskuraġni tul karreġġjata doppja tħaddan u ma ddejjaqh xejn. Ħabib qal lil New York Times: “Mullis kellu viżjoni li kien se jmut billi jaħbat maʼ siġra tas- redwood. Għalhekk, ma jibża’ minn xejn waqt is-sewqan, sakemm ma jkunx hemm siġar tas-redwood li jikbru mat-triq.” Il-preżenza ta 'redwoods tul it-triq ġiegħlet lil Mullis biex jikkonċentra u... hawn kien, ħarsa. Mullis irċieva l-Premju Nobel fil-Kimika għall-invenzjoni tiegħu fl-1993 u minn dakinhar sar saħansitra aktar strambi fl-azzjonijiet tiegħu. Pereżempju, huwa sostenitur tat-teorija reviżjonista li l-AIDS mhix relatata mal-HIV, li dgħajjef b'mod sinifikanti r-reputazzjoni tiegħu stess u interferiet mat-tobba.
PCR hija reazzjoni pjuttost sempliċi. Biex twettaqha, neħtieġu żewġ primers sintetizzati kimikament li huma komplementari għat-truf opposti ta 'fergħat differenti tal-framment tad-DNA meħtieġ. Primers huma sezzjonijiet qosra ta' DNA single-stranded, kull wieħed madwar 20 par bażi fit-tul. Il-partikolarità tal-primers hija li jikkorrispondu mat-taqsimiet tad-DNA li jeħtieġ li jiġu amplifikati, jiġifieri, il-mudell tad-DNA.
(Immaġini ikklikkjabbli) Kary Mullis, inventur tal-PCR
L-ispeċifiċità tal-PCR hija bbażata fuq il-formazzjoni ta 'kumplessi komplementari bejn il-mudell u l-primers, oligonukleotidi sintetiċi qosra. Kull primer huwa kumplimentari għal waħda mill-fergħat tal-mudell double-stranded u jillimita l-bidu u t-tmiem tar-reġjun amplifikat. Fil-fatt, il-"matriċi" li tirriżulta hija ġenoma sħiħ, u l-għan tagħna huwa li niżolaw il-frammenti ta 'interess għalina minnha. Biex tagħmel dan, il-mudell tad-DNA double-stranded jissaħħan sa 95 °C għal diversi minuti biex jisseparaw il-linji tad-DNA. Dan l-istadju jissejjaħ denaturazzjoni minħabba li r-rabtiet tal-idroġenu bejn iż-żewġ linji tad-DNA huma miksura. Ladarba l-fergħat ikunu sseparati, it-temperatura titbaxxa biex tippermetti li l-primers jorbtu mal-mudell ta 'single stranded. DNA polymerase tibda replikazzjoni tad-DNA billi torbot ma 'medda ta' katina nukleotide. L-enżima DNA polymerase tirreplika l-linja tal-mudell billi tuża primer bħala primer jew eżempju għall-ikkupjar. Bħala riżultat tal-ewwel ċiklu, niksbu rduppjar sekwenzjali multiplu ta 'ċerta sezzjoni tad-DNA. Sussegwentement nirrepetu din il-proċedura. Wara kull ċiklu niksbu żona fil-mira fi kwantità doppja. Wara ħamsa u għoxrin ċiklu PCR (jiġifieri f'inqas minn sagħtejn), għandna r-reġjun tad-DNA ta 'interess għalina f'ammont 225 darba ogħla mill-oriġinal (jiġifieri amplifikajna madwar 34 miljun darba). Fil-fatt, fl-input irċevejna taħlita ta 'primers, DNA template, l-enzima DNA polymerase u bażijiet ħielsa A, C, G u T, l-ammont ta' prodott ta 'reazzjoni speċifiku (limitat mill-primers) jikber b'mod esponenzjali, u n-numru ta '"twil" kopji tad-DNA hija lineari, għalhekk fil-prodotti ta' reazzjoni jiddomina.
Amplifikazzjoni tat-taqsima tad-DNA mixtieqa: reazzjoni katina tal-polimerażi
Fil-jiem bikrija tal-PCR, il-problema ewlenija kienet din li ġejja: wara kull ċiklu ta 'tisħin u tkessiħ, id-DNA polymerase kellha tiżdied mat-taħlita ta' reazzjoni, peress li kienet inattivata f'temperatura ta '95 ° C. Għalhekk, kien meħtieġ li terġa 'żżidha qabel kull wieħed mill-25 ċiklu. Il-proċedura ta 'reazzjoni kienet relattivament ineffiċjenti, kienet teħtieġ ħafna ħin u l-enzima tal-polimerażi, u l-materjal kien għali ħafna. Fortunatament, Omm Natura ġiet għas-salvataġġ. Ħafna annimali jħossuhom komdi f’temperaturi ferm ogħla minn 37 °C. Għaliex il-figura 37 °C saret importanti għalina? Dan ġara minħabba li din it-temperatura hija ottimali għal E. coli, li minnha oriġinarjament inkisbet l-enzima tal-polimerażi għall-PCR. Fin-natura hemm mikro-organiżmi li l-proteini tagħhom, fuq miljuni ta 'snin ta' għażla naturali, saru aktar reżistenti għal temperaturi għoljin. Ġie propost li jintużaw DNA polymerases minn batterji termofiliċi. Dawn l-enzimi rriżultaw li kienu termostabbli u kienu kapaċi jifilħu ħafna ċikli ta 'reazzjoni. L-użu tagħhom għamilha possibbli li tiġi ssimplifikata u awtomatizzata l-PCR. Waħda mill-ewwel polimerasi tad-DNA termostabbli kienet iżolata mill-batterju Thermus aquaticus, li jgħix fil-hot springs tal-Park Nazzjonali ta’ Yellowstone, u kien jismu Taq polymerase.
Il-PCR malajr sar ix-xogħol tal-Proġett tal-Ġenoma Uman. B'mod ġenerali, il-proċess mhuwiex differenti minn dak żviluppat minn Mullis, għadu kif ġie awtomatizzat. Aħna ma konna aktar dipendenti fuq folla ta 'studenti gradwati dim-witted tferra bi tbatija qtar ta' likwidu fit-tubi tat-test tal-plastik. F'laboratorji moderni li jwettqu riċerka ġenetika molekulari, dan ix-xogħol isir fuq conveyors robotiċi. Ir-robots tal-PCR involuti fi proġett ta’ sekwenzar kbir daqs il-Ġenoma tal-Bniedem jaħdmu bla waqfien b’volumi kbar ta’ polimerażi stabbli għas-sħana. Xi xjenzati li jaħdmu fuq il-Proġett tal-Ġenoma tal-Bniedem kienu rrabjati bir-royalties għolja mhux raġonevoli miżjuda mal-ispiża tal-konsumabbli mis-sid tal-privattiva tal-PCR, il-ġgant farmaċewtiku industrijali Ewropew Hoffmann-LaRoche.
"Prinċipju ta 'sewqan" ieħor kien il-metodu tas-sekwenzjar tad-DNA nnifsu. Il-bażi kimika ta 'dan il-metodu ma kinitx għadha ġdida f'dak iż-żmien: l-Interstate Human Genome Project (HGP) adotta l-istess metodu inġenjuż li Fred Sanger kien żviluppa lura f'nofs is-snin sebgħin. L-innovazzjoni kienet fl-iskala u l-grad ta 'awtomazzjoni li s-sekwenzjar kien kapaċi jikseb.
Is-sekwenzjar awtomatizzat kien oriġinarjament żviluppat fil-laboratorju ta 'Lee Hood fl-Istitut tat-Teknoloġija ta' Kalifornja. Huwa attenda l-iskola sekondarja f'Montana u lagħab futbol tal-kulleġġ bħala quarterback; Grazzi għal Hood, it-tim rebaħ il-kampjonat tal-istat aktar minn darba. Il-ħiliet tiegħu ta’ ħidma f’tim kienu wkoll utli fil-karriera xjentifika tiegħu. Il-laboratorju ta’ Hood kien imħaddem minn ekwipaġġ differenti ta’ kimiċi, bijoloġisti u inġiniera, u l-laboratorju tiegħu malajr sar mexxej fl-innovazzjoni teknoloġika.
Fil-fatt, il-metodu ta 'sekwenzjar awtomatizzat ġie ivvintat minn Lloyd Smith u Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, li dak iż-żmien kien jaħdem fil-laboratorju ta’ Hood, avviċina lil Lloyd Smith bi proposta għal metodu ta’ sekwenzar imtejjeb li fih kull tip ta’ bażi tkun ikkulurita b’mod differenti. Idea bħal din tista' tikkwadrupla l-effiċjenza tal-proċess Sanger. F'Sanger, meta ssir sekwenza f'kull wieħed mill-erba 'tubi (skond in-numru ta' bażijiet), bil-parteċipazzjoni ta 'DNA polymerase, jiġi ffurmat sett uniku ta' oligonukleotidi ta 'tulijiet differenti, inkluża sekwenza primer. Sussegwentement, formamide ġie miżjud mat-tubi għas-separazzjoni tal-katina u l-elettroforeżi tal-ġel tal-polyacrylamide saret fuq erba 'korsiji. Fil-verżjoni ta 'Smith u Hunkapiller, id-dideoxynucleotides huma ttikkettjati b'erba' żebgħa differenti u l-PCR titwettaq f'tubu wieħed. Imbagħad, waqt l-elettroforesi tal-ġel tal-polyacrylamide, raġġ tal-lejżer f'post speċifiku fuq il-ġel iħeġġeġ l-attività taż-żebgħa, u d-ditekter jiddetermina liema nukleotide bħalissa qed jemigra permezz tal-ġel. Għall-ewwel, Smith kien pessimist - beża 'li l-użu ta' dożi ultra-baxxi ta 'żebgħa jwassal biex ir-reġjuni tan-nukleotidi ma jkunux jistgħu jintgħarfu. Madankollu, wara li fehem eċċellenti tat-teknoloġija tal-lejżer, dalwaqt sab mod kif joħroġ mis-sitwazzjoni billi uża żebgħat fluworokromi speċjali li jiffluworexxew meta jkunu esposti għar-radjazzjoni tal-lejżer.
(Verżjoni sħiħa - 4,08 MB) Stampa fina: Sekwenza tad-DNA sekwenzata bl-użu ta' sekwencer awtomatiku, miksub minn magna awtomatika ta' sekwenzar. Kull kulur jikkorrispondi għal waħda minn erba 'bażijiet
Fil-verżjoni klassika tal-metodu Sanger, waħda mill-fergħat tad-DNA analizzata taġixxi bħala mudell għas-sintesi ta 'linja komplementari mill-enzima DNA polymerase, imbagħad is-sekwenza ta' frammenti tad-DNA hija magħżula f'ġel skond id-daqs. Kull framment, li huwa inkluż fid-DNA waqt is-sintesi u jippermetti viżwalizzazzjoni sussegwenti ta 'prodotti ta' reazzjoni, huwa ttikkettjat b'żebgħa fluworexxenti li tikkorrispondi għall-bażi terminali (dan ġie diskuss f'p. 124); għalhekk, il-fluworexxenza ta 'dan il-framment se tkun identifikatur għal bażi partikolari. Imbagħad kulma jibqa 'huwa li twettaq skoperta u Ħares il-prodotti ta' reazzjoni. Ir-riżultati huma analizzati bil-kompjuter u ppreżentati bħala sekwenza ta 'qċaċet b'ħafna kuluri li jikkorrispondu għal erba' nukleotidi. L-informazzjoni mbagħad tiġi trasferita direttament lis-sistema ta 'informazzjoni tal-kompjuter, u b'hekk jiġi eliminat il-proċess ta' dħul tad-dejta li jieħu ħafna ħin u kultant ta 'uġigħ li għamel is-sekwenzjar diffiċli ħafna.
» Għal aktar informazzjoni dwar il-ktieb, jekk jogħġbok żur
»
»
Għal Khabrozhiteli 25% skont fuq il-kupun - PCR
Sors: www.habr.com