Amerikalik kimyo bo‘yicha Nobel mukofoti sovrindori Keri Mullis Kaliforniyada 74 yoshida vafot etdi. Uning rafiqasiga ko'ra, o'lim 7 avgust kuni sodir bo'lgan. Buning sababi pnevmoniya tufayli yurak va nafas olish etishmovchiligi.
DNK molekulasini kashf etgan Jeyms Uotsonning o'zi bizga biokimyoga qo'shgan hissasi va Nobel mukofotini olgani haqida gapirib beradi.
Jeyms Uotson, Endryu Berri, Kevin Devis kitobidan parcha
DNK. Genetik inqilob tarixi
7-bob. Inson genomi. Hayot stsenariysi
...
Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) 1983 yilda Cetusda ishlagan biokimyogar Keri Mullis tomonidan ixtiro qilingan. Ushbu reaktsiyaning kashfiyoti juda ajoyib edi. Mullis keyinroq shunday deb esladi: “1983 yil aprel oyining bir juma kuni oqshomida men hayajonga tushdim. Men rulda o‘tirgandim, qirmizi o‘rmonlar o‘lkasi bo‘lmish Shimoliy Kaliforniyada oy yoritilgan, burilishli tog‘ yo‘li bo‘ylab ketayotgan edim”. Bunday vaziyatda unga ilhom tushgani hayratlanarli. Va bu shimoliy Kaliforniyada tushunchani targ'ib qiluvchi maxsus yo'llarga ega emas; shunchaki uning do'sti bir marta Mullisning muzli qo'shaloq qatnov qismida ehtiyotsiz tezlikda ketayotganini ko'rgan va bu uni umuman bezovta qilmagan. Bir do'stim Nyu-York Taymsga shunday dedi: "Mullis qizil daraxtga urilib o'lishini vahiy qilgan. Shuning uchun u haydab ketayotganda hech narsadan qo'rqmaydi, agar yo'l bo'yida qizil daraxtlar o'smasa. Yo'l bo'yida qizil o'rmonlarning mavjudligi Mullisni diqqatini jamlashga majbur qildi va ... mana bu tushuncha edi. Mullis 1993 yilda o'z ixtirosi uchun kimyo bo'yicha Nobel mukofotiga sazovor bo'ldi va o'shandan beri uning harakatlarida g'alati bo'lib qoldi. Masalan, u OITSning OIV bilan bog'liq emasligi haqidagi revizionistik nazariyaning tarafdori bo'lib, bu uning obro'siga putur etkazdi va shifokorlar bilan aralashdi.
PCR - bu juda oddiy reaktsiya. Uni amalga oshirish uchun bizga kerakli DNK fragmentining turli zanjirlarining qarama-qarshi uchlarini to'ldiruvchi ikkita kimyoviy sintezlangan primer kerak. Primerlar bir zanjirli DNKning qisqa bo'limlari bo'lib, ularning har biri 20 ta tayanch juft uzunlikda. Primerlarning o'ziga xos xususiyati shundaki, ular kuchaytirilishi kerak bo'lgan DNK bo'limlariga, ya'ni DNK shabloniga mos keladi.
(Rasmni bosish mumkin) Kari Mullis, PCR ixtirochisi
PCR ning o'ziga xosligi shablon va primerlar, qisqa sintetik oligonükleotidlar o'rtasida komplementar komplekslarning shakllanishiga asoslanadi. Har bir primer ikki qatorli shablonning iplaridan biriga qo'shimcha bo'lib, kuchaytirilgan hududning boshi va oxirini cheklaydi. Aslida, hosil bo'lgan "matritsa" butun genom bo'lib, bizning maqsadimiz bizni qiziqtirgan bo'laklarni undan ajratib olishdir. Buning uchun ikki zanjirli DNK shablonini DNK zanjirlarini ajratish uchun bir necha daqiqa davomida 95 °C ga qadar qizdiriladi. Bu bosqich denaturatsiya deb ataladi, chunki ikkita DNK zanjiri orasidagi vodorod aloqalari uziladi. Iplar ajratilgandan so'ng, astarlarni bir ipli shablonga bog'lash uchun harorat tushiriladi. DNK polimeraza nukleotid zanjirining bir qismiga ulanish orqali DNK replikatsiyasini boshlaydi. DNK polimeraza fermenti astar yoki nusxa ko'chirish uchun namuna sifatida primer yordamida shablon ipini takrorlaydi. Birinchi tsikl natijasida biz ma'lum bir DNK bo'limining bir necha marta ketma-ket ikkilanishini olamiz. Keyin biz ushbu protsedurani takrorlaymiz. Har bir tsikldan so'ng biz ikki barobar miqdorda maqsadli maydonni olamiz. Yigirma beshta PCR tsiklidan so'ng (ya'ni ikki soatdan kamroq vaqt ichida) bizni qiziqtirgan DNK mintaqasi asl nusxadan 225 baravar yuqori (ya'ni biz uni taxminan 34 million marta kuchaytirdik). Aslida, kirishda biz primerlar, shablon DNK, DNK polimeraza fermenti va erkin asoslar A, C, G va T aralashmasini oldik, ma'lum bir reaksiya mahsuloti miqdori (primerlar bilan cheklangan) eksponent ravishda o'sadi va soni "uzoq" DNK nusxalari chiziqli, shuning uchun reaktsiyada mahsulotlar ustunlik qiladi.
Kerakli DNK bo'limining kuchaytirilishi: polimeraza zanjiri reaktsiyasi
PCRning dastlabki kunlarida asosiy muammo quyidagilar edi: har bir isitish-sovutish siklidan so'ng, DNK polimeraza reaktsiya aralashmasiga qo'shilishi kerak edi, chunki u 95 ° C haroratda inaktivatsiya qilingan. Shuning uchun, 25 tsiklning har biridan oldin uni qayta qo'shish kerak edi. Reaktsiya jarayoni nisbatan samarasiz bo'lib, ko'p vaqt va polimeraza fermentini talab qildi va material juda qimmat edi. Yaxshiyamki, ona tabiat yordamga keldi. Ko'pgina hayvonlar 37 ° C dan yuqori haroratlarda o'zlarini qulay his qilishadi. Nima uchun 37 °C ko'rsatkichi biz uchun muhim bo'lib qoldi? Buning sababi, bu harorat E. coli uchun optimal bo'lib, dastlab PCR uchun polimeraza fermenti olingan. Tabiatda mikroorganizmlar mavjud bo'lib, ularning oqsillari millionlab yillar davomida tabiiy tanlanish natijasida yuqori haroratga chidamli bo'lib qoldi. Termofil bakteriyalardan DNK polimerazalaridan foydalanish taklif qilingan. Bu fermentlar termostabil bo'lib chiqdi va ko'plab reaktsiya davrlariga bardosh bera oldi. Ulardan foydalanish PCRni soddalashtirish va avtomatlashtirish imkonini berdi. Birinchi termostabil DNK polimerazalaridan biri Yelloustoun milliy bog'ining issiq buloqlarida yashovchi Thermus aquaticus bakteriyasidan ajratib olingan va unga Taq polimeraza nomi berilgan.
PCR tezda inson genomi loyihasining asosiy omiliga aylandi. Umuman olganda, jarayon Mullis tomonidan ishlab chiqilganidan farq qilmaydi, u endigina avtomatlashtirilgan. Biz endi plastik probirkalarga suyuqlik tomchilarini mashaqqat bilan to'kayotgan ongsiz aspirantlar olomoniga qaram emas edik. Molekulyar genetik tadqiqotlar olib boruvchi zamonaviy laboratoriyalarda bu ish robotlashtirilgan konveyerlarda bajariladi. Inson genomi kabi katta hajmdagi sekvensiya loyihasida ishtirok etgan PCR robotlari katta hajmdagi issiqlikka bardoshli polimeraza bilan tinimsiz ishlaydi. Inson genomi loyihasi ustida ishlayotgan ba'zi olimlar PCR patenti egasi, Evropa sanoat farmatsevtika giganti Hoffmann-LaRoche tomonidan sarflanadigan materiallar narxiga qo'shilgan asossiz yuqori royaltidan g'azablanishdi.
Yana bir "haydash printsipi" DNK ketma-ketligi usulining o'zi edi. Ushbu usulning kimyoviy asosi o'sha paytda endi yangi emas edi: Davlatlararo inson genomi loyihasi (HGP) Fred Sanger 1970-yillarning o'rtalarida ishlab chiqqan bir xil aqlli usulni qo'lladi. Innovatsiya avtomatlashtirishning ko'lami va darajasida edi, bu ketma-ketlik erisha oldi.
Avtomatlashtirilgan ketma-ketlik dastlab Li Gudning Kaliforniya texnologiya institutidagi laboratoriyasida ishlab chiqilgan. U Montana shtatidagi o'rta maktabda o'qigan va kollejda yarim himoyachi sifatida futbol o'ynagan; Hud tufayli jamoa bir necha marta davlat chempionligini qo'lga kiritdi. Uning jamoada ishlash qobiliyati ilmiy faoliyatida ham qo‘l keldi. Hudning laboratoriyasida kimyogarlar, biologlar va muhandislarning rang-barang ekipaji bor edi va uning laboratoriyasi tez orada texnologik innovatsiyalar bo'yicha etakchiga aylandi.
Aslida, avtomatlashtirilgan ketma-ketlik usuli Lloyd Smit va Mayk Hunkapiller tomonidan ixtiro qilingan. O'sha paytda Hudning laboratoriyasida ishlagan Mayk Xunkapiller Lloyd Smitga takomillashtirilgan ketma-ketlik usuli taklifi bilan murojaat qildi, unda har bir baza turi boshqacha rangda bo'ladi. Bunday g'oya Sanger jarayonining samaradorligini to'rt barobar oshirishi mumkin. Sangerda to'rtta naychaning har birida (asoslar soni bo'yicha) ketma-ketlikda DNK polimeraza ishtirokida turli uzunlikdagi oligonukleotidlarning noyob to'plami, shu jumladan primer ketma-ketligi hosil bo'ladi. Keyinchalik, zanjirni ajratish uchun naychalarga formamid qo'shildi va to'rtta chiziqda poliakrilamid jel elektroforezi amalga oshirildi. Smit va Hunkapiller versiyasida dideoksinukleotidlar to'rt xil bo'yoq bilan belgilanadi va PCR bitta naychada amalga oshiriladi. Keyin, poliakrilamid gel elektroforezi paytida, jelning ma'lum bir joyidagi lazer nurlari bo'yoqlarning faolligini qo'zg'atadi va detektor hozirda jel orqali qaysi nukleotid ko'chib o'tayotganini aniqlaydi. Dastlab, Smit pessimistik edi - u juda past dozalarda bo'yoqlardan foydalanish nukleotid hududlarini ajratib bo'lmaydigan bo'lishiga olib kelishidan qo'rqardi. Biroq, lazer texnologiyasini juda yaxshi tushungan holda, u tez orada lazer nurlanishiga duchor bo'lganida lyuminestsatsiya qiluvchi maxsus ftorxrom bo'yoqlardan foydalangan holda vaziyatdan chiqish yo'lini topdi.
(To'liq versiya - 4,08 MB) Nozik chop etish: DNK ketma-ketligi avtomatik sekvenser yordamida avtomatik sekvensiyalash mashinasidan olingan. Har bir rang to'rtta asosdan biriga mos keladi
Sanger usulining klassik versiyasida tahlil qilingan DNKning iplaridan biri DNK polimeraza fermenti tomonidan komplementar zanjir sintezi uchun shablon bo'lib xizmat qiladi, so'ngra DNK bo'laklarining ketma-ketligi o'lchamlari bo'yicha jelda saralanadi. Sintez paytida DNK tarkibiga kiritilgan va reaktsiya mahsulotlarini keyinchalik vizualizatsiya qilish imkonini beruvchi har bir parcha terminal bazasiga mos keladigan floresan bo'yoq bilan etiketlanadi (bu 124-betda muhokama qilingan); shuning uchun bu fragmentning floresansi ma'lum asos uchun identifikator bo'ladi. Keyin qolgan narsa reaktsiya mahsulotlarini aniqlash va vizualizatsiya qilishdir. Natijalar kompyuter orqali tahlil qilinadi va to'rtta nukleotidga mos keladigan ko'p rangli tepaliklar ketma-ketligi sifatida taqdim etiladi. Keyinchalik ma'lumotlar to'g'ridan-to'g'ri kompyuterning axborot tizimiga uzatiladi, bu ketma-ketlikni juda qiyinlashtirgan ma'lumotlarni kiritish vaqtini talab qiluvchi va ba'zan og'riqli jarayonni yo'q qiladi.
» Kitob haqida batafsil ma’lumotni quyidagi manzildan olishingiz mumkin
»
»
Xabrozhiteley uchun kupondan foydalangan holda 25% chegirma - PCR
Manba: www.habr.com