Bandaríski Nóbelsverðlaunahafinn í efnafræði Kary Mullis lést í Kaliforníu, 74 ára að aldri. Að sögn eiginkonu hans varð andlátið 7. ágúst. Orsökin er hjarta- og öndunarbilun vegna lungnabólgu.
James Watson sjálfur, uppgötvandi DNA sameindarinnar, mun segja okkur frá framlagi sínu til lífefnafræðinnar og fyrir það hlaut hann Nóbelsverðlaunin.
Brot úr bók eftir James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
DNA. Saga erfðabyltingarinnar
Kafli 7. Erfðamengi mannsins. Atburðarás lífsins
...
Polymerasa keðjuverkun (PCR) var fundin upp árið 1983 af lífefnafræðingnum Carey Mullis, sem starfaði hjá Cetus. Uppgötvun þessara viðbragða var nokkuð merkileg. Mullis rifjaði upp síðar: „Föstudagskvöld eitt í apríl 1983 fékk ég skýringarmynd. Ég var undir stýri og keyrði niður tunglsljósan, hlykkjóttan fjallveg í Norður-Kaliforníu, landi rauðviðarskóga.“ Það er áhrifamikið að það var í slíkum aðstæðum sem innblástur sló hann. Og það er ekki það að Norður-Kalifornía hafi sérstaka vegi sem stuðla að innsýn; það er bara það að vinur hans sá Mullis einu sinni keyra kæruleysislega eftir ískaldri akbraut og það truflaði hann alls ekki. Vinur sagði við New York Times: „Mullis sá fyrir sér að hann myndi deyja með því að rekast á rauðviðartré. Þess vegna óttast hann ekkert í akstri, nema það séu rauðviðartré sem vaxa meðfram veginum.“ Tilvist rauðviðar meðfram veginum neyddi Mullis til að einbeita sér og ... hér var það, innsýn. Mullis fékk Nóbelsverðlaunin í efnafræði fyrir uppfinningu sína árið 1993 og hefur síðan orðið enn undarlegri í gjörðum sínum. Til dæmis er hann stuðningsmaður endurskoðunarkenningarinnar um að alnæmi tengist ekki HIV, sem grafi verulega undan eigin orðstír og trufla lækna.
PCR er frekar einföld viðbrögð. Til að framkvæma það þurfum við tvo efnafræðilega tilbúna primera sem eru viðbót við gagnstæða enda mismunandi þráða nauðsynlegs DNA brots. Grunnur eru stuttir hlutar af einþátta DNA, hver um sig um 20 basapör að lengd. Sérkenni primers er að þeir samsvara DNA hlutanum sem þarf að magna upp, það er DNA sniðmátinu.
(Smellanleg mynd) Kary Mullis, uppfinningamaður PCR
Sérhæfni PCR byggist á myndun fyllingarfléttna á milli sniðmátsins og fruma, stuttra tilbúinna fákjarna. Hver primer er viðbót við einn af þráðum tvíþátta sniðmátsins og takmarkar upphaf og lok magnaða svæðisins. Í raun er „fylki“ sem myndast heilt erfðamengi og markmið okkar er að einangra brotin sem vekur áhuga okkar frá því. Til að gera þetta er tvíþátta DNA sniðmátið hitað í 95 °C í nokkrar mínútur til að aðskilja DNA strengina. Þetta stig er kallað eðlisbreyting vegna þess að vetnistengin milli DNA-þræðanna tveggja eru rofin. Þegar þræðir hafa aðskilið er hitastigið lækkað til að leyfa primerunum að bindast einþátta sniðmátinu. DNA pólýmerasi byrjar DNA eftirmyndun með því að bindast teygju af núkleótíðkeðju. Ensímið DNA pólýmerasi endurtekur sniðmátstrenginn með því að nota primer sem primer eða dæmi til að afrita. Sem afleiðing af fyrstu lotunni fáum við margfalda tvöföldun í röð á ákveðnum DNA hluta. Næst endurtökum við þessa aðferð. Eftir hverja lotu fáum við marksvæði í tvöföldu magni. Eftir tuttugu og fimm PCR-lotur (þ.e. á innan við tveimur klukkustundum) höfum við DNA-svæðið sem vekur áhuga okkar í magni sem er 225 sinnum hærra en upprunalega (þ.e. við höfum magnað það um það bil 34 milljón sinnum). Reyndar, við inntakið fengum við blöndu af frumurum, sniðmáti DNA, DNA pólýmerasa ensími og frjálsum basum A, C, G og T, magn tiltekinnar hvarfafurðar (takmarkað af frumum) vex veldishraða og fjöldi " löng“ DNA eintök eru línuleg, þannig að hvarfefni eru allsráðandi.
Mögnun á viðkomandi DNA hluta: pólýmerasa keðjuverkun
Á fyrstu dögum PCR var aðalvandamálið eftirfarandi: eftir hverja upphitunar- og kælingulotu þurfti að bæta DNA pólýmerasa við hvarfblönduna þar sem hún var óvirkjuð við 95°C hita. Þess vegna var nauðsynlegt að bæta því við aftur fyrir hverja af 25 lotunum. Viðbragðsferlið var tiltölulega óhagkvæmt, tók mikinn tíma og pólýmerasa ensímið og efnið var mjög dýrt. Sem betur fer kom móðir náttúra til bjargar. Mörgum dýrum líður vel við hitastig sem er miklu hærra en 37°C. Hvers vegna varð talan 37 °C mikilvæg fyrir okkur? Þetta gerðist vegna þess að þetta hitastig er ákjósanlegt fyrir E. coli, þaðan sem pólýmerasa ensímið fyrir PCR var upphaflega fengið. Í náttúrunni eru örverur þar sem prótein þeirra hafa, yfir milljón ára náttúruval, orðið ónæmari fyrir háum hita. Lagt hefur verið til að nota DNA pólýmerasa úr hitakærum bakteríum. Þessi ensím reyndust hitastöðug og þola margar hvarflotur. Notkun þeirra gerði það mögulegt að einfalda og gera PCR sjálfvirkan. Einn af fyrstu hitastöðugustu DNA-pólýmerasunum var einangraður úr bakteríunni Thermus aquaticus, sem lifir í hverum Yellowstone-þjóðgarðsins, og fékk nafnið Taq-pólýmerasi.
PCR varð fljótt vinnuhestur Human Genome Project. Almennt séð er ferlið ekkert frábrugðið því sem Mullis þróaði, það hefur bara verið sjálfvirkt. Við vorum ekki lengur háð því að hópur hálfvitra útskriftarnema hellti vandlega dropum af vökva í plasttilraunaglös. Í nútíma rannsóknarstofum sem stunda sameindaerfðafræðilegar rannsóknir er þessi vinna unnin á vélfærabúnaði. PCR vélmenni sem taka þátt í raðgreiningarverkefni eins stórt og erfðamengi mannsins vinna stanslaust með miklu magni af hitastöðugleika pólýmerasa. Sumir vísindamenn sem unnu að Human Genome Project voru reiðir yfir óeðlilega háum þóknanir sem eigandi PCR einkaleyfisins, evrópska iðnaðarlyfjarisinn Hoffmann-LaRoche, bætti við kostnað við rekstrarvörur.
Önnur „akstursregla“ var sjálf DNA raðgreiningaraðferðin. Efnafræðilegur grundvöllur þessarar aðferðar var ekki lengur nýr á þeim tíma: Interstate Human Genome Project (HGP) tók upp sömu snjöllu aðferðina og Fred Sanger hafði þróað aftur um miðjan áttunda áratuginn. Nýjungin fólst í umfangi og sjálfvirkni sem raðgreining gat náð.
Sjálfvirk raðgreining var upphaflega þróuð á rannsóknarstofu Lee Hood við California Institute of Technology. Hann gekk í menntaskóla í Montana og spilaði háskólabolta sem bakvörður; Þökk sé Hood vann liðið fylkismeistaratitilinn oftar en einu sinni. Samstarfshæfileikar hans komu einnig að góðum notum á vísindaferli hans. Rannsóknarstofa Hoods var mönnuð af flókinni áhöfn efnafræðinga, líffræðinga og verkfræðinga og rannsóknarstofa hans varð fljótlega leiðandi í tækninýjungum.
Reyndar var sjálfvirka raðgreiningaraðferðin fundin upp af Lloyd Smith og Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, sem þá starfaði á rannsóknarstofu Hood, leitaði til Lloyd Smith með tillögu að bættri raðgreiningaraðferð þar sem hver tegund af grunni yrði lituð á annan hátt. Slík hugmynd gæti fjórfaldað skilvirkni Sanger ferlisins. Í Sanger, við raðgreiningu í hverju af fjórum rörum (samkvæmt fjölda basa), með þátttöku DNA-pólýmerasa, myndast einstakt mengi fákjarna af mismunandi lengd, þar á meðal grunnröð. Því næst var formamíði bætt við rörin til að aðskilja keðjuna og pólýakrýlamíð hlaup rafskaut var framkvæmd á fjórum brautum. Í útgáfu Smith og Hunkapiller eru dideoxýnukleótíð merkt með fjórum mismunandi litarefnum og PCR er framkvæmt í einni túpu. Síðan, meðan á pólýakrýlamíð hlaup rafdrætti stendur, vekur leysigeisli á tilteknum stað á hlaupinu virkni litarefnanna og skynjarinn ákvarðar hvaða kirni er nú að flæða í gegnum hlaupið. Í fyrstu var Smith svartsýnn - hann óttaðist að notkun ofurlítilla skammta af litarefni myndi leiða til þess að núkleótíðsvæðin yrðu ekki aðgreind. Hins vegar, með frábæran skilning á leysitækni, fann hann fljótlega leið út úr ástandinu með því að nota sérstaka flúorókróm litarefni sem flúrljóma þegar þau verða fyrir leysigeislun.
(Full útgáfa - 4,08 MB) Smáletrið: DNA röð raðgreind með sjálfvirkri raðgreiningu, fengin úr sjálfvirkri raðgreiningarvél. Hver litur samsvarar einum af fjórum grunnum
Í klassískri útgáfu Sanger-aðferðarinnar virkar einn af þráðum greinds DNA sem sniðmát fyrir myndun viðbótarstrengs með ensíminu DNA pólýmerasa, síðan er röð DNA-búta flokkuð í hlaupi eftir stærð. Hvert brot, sem er innifalið í DNA meðan á myndun stendur og gerir það kleift að sjá hvarfefni í kjölfarið, er merkt með flúrljómandi litarefni sem samsvarar endastöðinni (þetta var rætt á bls. 124); þess vegna mun flúrljómun þessa brots vera auðkenni fyrir tiltekinn basa. Þá er allt sem eftir er að framkvæma uppgötvun og sjá hvarfefnin. Niðurstöðurnar eru greindar með tölvu og settar fram sem röð marglita toppa sem samsvara fjórum núkleótíðum. Upplýsingarnar eru síðan fluttar beint yfir í upplýsingakerfi tölvunnar og útilokar það tímafreka og stundum sársaukafulla gagnafærsluferli sem gerði raðgreiningu mjög erfiða.
» Nánari upplýsingar um bókina má finna á
»
»
Fyrir Khabrozhiteley 25% afslátt með afsláttarmiða - PCR
Heimild: www.habr.com