Americký nositeľ Nobelovej ceny za chémiu Kary Mullis zomrel v Kalifornii vo veku 74 rokov. Podľa jeho manželky smrť nastala 7. augusta. Príčinou je zlyhanie srdca a dýchania v dôsledku zápalu pľúc.
Sám James Watson, objaviteľ molekuly DNA, nám porozpráva o svojom prínose do biochémie a za ktorý dostal Nobelovu cenu.
Úryvok z knihy Jamesa Watsona, Andrewa Berryho, Kevina Davisa
DNA. História genetickej revolúcie
Kapitola 7. Ľudský genóm. Životný scenár
...
Polymerázovú reťazovú reakciu (PCR) vynašiel v roku 1983 biochemik Carey Mullis, ktorý pracoval v Cetus. Objav tejto reakcie bol celkom pozoruhodný. Mullis neskôr spomínal: „V jeden piatok večer v apríli 1983 som mal zjavenie. Sedel som za volantom a jazdil som po mesačnej kľukatej horskej ceste v severnej Kalifornii, krajine sekvojových lesov.“ Je pôsobivé, že práve v takejto situácii ho zasiahla inšpirácia. A nie je to tak, že severná Kalifornia má špeciálne cesty, ktoré podporujú pochopenie; len jeho priateľ raz videl Mullisa, ako sa bezohľadne rúti po zľadovatenej dvojprúdovej ceste, a vôbec ho to netrápilo. Jeden priateľ povedal pre New York Times: „Mullis mal víziu, že zomrie nárazom do sekvoje. Preto sa počas jazdy ničoho nebojí, pokiaľ popri ceste nerastú sekvoje.“ Prítomnosť sekvojí pozdĺž cesty prinútila Mullisa sústrediť sa a... tu to bolo, pochopenie. Mullis dostal za svoj vynález v roku 1993 Nobelovu cenu za chémiu a odvtedy sa vo svojich činoch stal ešte čudnejším. Je napríklad zástancom revizionistickej teórie, že AIDS nesúvisí s HIV, čo výrazne podkopalo jeho vlastnú povesť a prekážalo lekárom.
PCR je pomerne jednoduchá reakcia. Na jeho uskutočnenie potrebujeme dva chemicky syntetizované priméry, ktoré sú komplementárne k opačným koncom rôznych reťazcov požadovaného fragmentu DNA. Priméry sú krátke úseky jednovláknovej DNA, každý s dĺžkou približne 20 párov báz. Zvláštnosťou primerov je, že zodpovedajú úsekom DNA, ktoré je potrebné amplifikovať, teda templátu DNA.
(Kliknite na obrázok) Kary Mullis, vynálezca PCR
Špecifickosť PCR je založená na tvorbe komplementárnych komplexov medzi templátom a primérmi, krátkymi syntetickými oligonukleotidmi. Každý z primérov je komplementárny k jednému z vlákien dvojvláknového templátu a obmedzuje začiatok a koniec amplifikovanej oblasti. V skutočnosti je výsledná „matrica“ celý genóm a naším cieľom je izolovať z neho fragmenty, ktoré nás zaujímajú. Aby sa to dosiahlo, templát dvojvláknovej DNA sa niekoľko minút zahrieva na 95 °C, aby sa oddelili vlákna DNA. Toto štádium sa nazýva denaturácia, pretože vodíkové väzby medzi dvoma reťazcami DNA sú prerušené. Akonáhle sa vlákna oddelia, teplota sa zníži, aby sa umožnilo primérom naviazať sa na jednovláknový templát. DNA polymeráza začína replikáciu DNA väzbou na úsek nukleotidového reťazca. Enzým DNA polymeráza replikuje templátový reťazec pomocou priméru ako priméru alebo príkladu na kopírovanie. V dôsledku prvého cyklu získame viacnásobné postupné zdvojenie určitého úseku DNA. Ďalej tento postup zopakujeme. Po každom cykle získame cieľovú oblasť v dvojnásobnom množstve. Po dvadsiatich piatich cykloch PCR (teda za menej ako dve hodiny) máme oblasť DNA, ktorá nás zaujíma, v množstve 225-krát vyššom ako pôvodná (to znamená, že sme ju amplifikovali približne 34 miliónov krát). V skutočnosti sme na vstupe dostali zmes primerov, templátovej DNA, enzýmu DNA polymerázy a voľných báz A, C, G a T, množstvo špecifického reakčného produktu (obmedzeného primérmi) rastie exponenciálne a počet „dlhých“ kópií DNA je lineárny, takže v reakcii dominujú produkty.
Amplifikácia požadovaného úseku DNA: polymerázová reťazová reakcia
V prvých dňoch PCR bol hlavný problém nasledujúci: po každom cykle zahrievania a chladenia sa do reakčnej zmesi musela pridať DNA polymeráza, pretože bola inaktivovaná pri teplote 95 ° C. Preto ho bolo potrebné pred každým z 25 cyklov znovu pridať. Reakčný postup bol relatívne neefektívny, vyžadoval veľa času a enzýmu polymerázy a materiál bol veľmi drahý. Našťastie prišla na pomoc matka príroda. Mnohé zvieratá sa cítia pohodlne pri teplotách oveľa vyšších ako 37 °C. Prečo sa pre nás stal dôležitý údaj 37 °C? Stalo sa tak preto, lebo táto teplota je optimálna pre E. coli, z ktorej sa pôvodne získal enzým polymeráza pre PCR. V prírode existujú mikroorganizmy, ktorých proteíny sa v priebehu miliónov rokov prirodzeného výberu stali odolnejšími voči vysokým teplotám. Bolo navrhnuté použiť DNA polymerázy z termofilných baktérií. Ukázalo sa, že tieto enzýmy sú termostabilné a boli schopné odolať mnohým reakčným cyklom. Ich použitie umožnilo zjednodušiť a zautomatizovať PCR. Jedna z prvých termostabilných DNA polymeráz bola izolovaná z baktérie Thermus aquaticus, ktorá žije v horúcich prameňoch Yellowstonského národného parku, a dostala názov Taq polymeráza.
PCR sa rýchlo stala ťažným koňom projektu Human Genome Project. Vo všeobecnosti sa tento proces nelíši od procesu vyvinutého Mullisom, bol len zautomatizovaný. Už sme neboli závislí od davu matných postgraduálnych študentov, ktorí usilovne nalievali kvapôčky tekutiny do plastových skúmaviek. V moderných laboratóriách vykonávajúcich molekulárne genetický výskum sa táto práca vykonáva na robotických dopravníkoch. Roboty PCR zapojené do sekvenčného projektu veľkého ako ľudský genóm neúnavne pracujú s obrovskými objemami tepelne stabilnej polymerázy. Niektorých vedcov pracujúcich na projekte Human Genome Project pobúrili neprimerane vysoké licenčné poplatky, ktoré majiteľ patentu PCR, európsky priemyselný farmaceutický gigant Hoffmann-LaRoche, pridal k nákladom na spotrebný materiál.
Ďalším „hnacím princípom“ bola samotná metóda sekvenovania DNA. Chemický základ tejto metódy už v tom čase nebol nový: Interstate Human Genome Project (HGP) prijal rovnakú dômyselnú metódu, akú vyvinul Fred Sanger v polovici 1970. rokov. Inovácia spočívala v rozsahu a stupni automatizácie, ktorý bolo sekvenovanie schopné dosiahnuť.
Automatizované sekvenovanie bolo pôvodne vyvinuté v laboratóriu Lee Hooda na California Institute of Technology. Navštevoval strednú školu v Montane a hral univerzitný futbal ako rozohrávač; Vďaka Hoodovi tím vyhral štátny šampionát viac ako raz. Jeho schopnosti tímovej práce prišli vhod aj vo vedeckej kariére. V Hoodovom laboratóriu pracovala pestrá skupina chemikov, biológov a inžinierov a jeho laboratórium sa čoskoro stalo lídrom v technologických inováciách.
V skutočnosti metódu automatizovaného sekvenovania vynašli Lloyd Smith a Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, ktorý vtedy pracoval v Hoodovom laboratóriu, oslovil Lloyda Smitha s návrhom na vylepšenú metódu sekvenovania, v ktorej by bol každý typ bázy zafarbený inak. Takáto myšlienka by mohla štvornásobne zvýšiť účinnosť Sangerovho procesu. V Sangerovi sa pri sekvenovaní v každej zo štyroch skúmaviek (podľa počtu báz) za účasti DNA polymerázy vytvorí jedinečný súbor oligonukleotidov rôznych dĺžok, vrátane sekvencie primérov. Potom sa do skúmaviek pridal formamid na oddelenie reťazcov a na štyroch dráhach sa uskutočnila elektroforéza na polyakrylamidovom géli. Vo verzii Smitha a Hunkapillera sú dideoxynukleotidy označené štyrmi rôznymi farbivami a PCR sa uskutočňuje v jednej skúmavke. Potom počas elektroforézy na polyakrylamidovom géli laserový lúč na špecifickom mieste gélu vybudí aktivitu farbív a detektor určí, ktorý nukleotid práve migruje cez gél. Smith bol spočiatku pesimistický – obával sa, že použitie ultranízkych dávok farbiva povedie k nerozoznaniu nukleotidových oblastí. Keďže však mal vynikajúce znalosti o laserovej technológii, čoskoro našiel východisko zo situácie pomocou špeciálnych fluorochrómových farbív, ktoré pri vystavení laserovému žiareniu fluoreskujú.
(Plná verzia - 4,08 MB) Malým písmom: Sekvencia DNA sekvenovaná pomocou automatického sekvenátora získaná z automatického sekvenačného zariadenia. Každá farba zodpovedá jednému zo štyroch základov
V klasickej verzii Sangerovej metódy jedno z reťazcov analyzovanej DNA pôsobí ako templát pre syntézu komplementárneho reťazca enzýmom DNA polymerázou, potom sa sekvencia fragmentov DNA triedi v géli podľa veľkosti. Každý fragment, ktorý je zahrnutý v DNA počas syntézy a umožňuje následnú vizualizáciu reakčných produktov, je označený fluorescenčným farbivom zodpovedajúcim terminálnej báze (o tom bolo diskutované na str. 124); preto fluorescencia tohto fragmentu bude identifikátorom pre danú bázu. Potom už zostáva len vykonať detekciu a vizualizovať produkty reakcie. Výsledky sú analyzované počítačom a prezentované ako sekvencia viacfarebných píkov zodpovedajúcich štyrom nukleotidom. Informácie sa potom prenesú priamo do informačného systému počítača, čím sa eliminuje časovo náročný a niekedy bolestivý proces zadávania údajov, ktorý veľmi sťažoval sekvenovanie.
» Viac podrobností o knihe nájdete na
»
»
Pre Khabrozhitely zľavu 25 % pomocou kupónu - PCR
Zdroj: hab.com