Амерички нобеловац за хемију Кари Мулис преминуо је у Калифорнији у 74. години. Према речима његове супруге, смрт се догодила 7. августа. Узрок је срчана и респираторна инсуфицијенција због упале плућа.
О свом доприносу биохемији и за који је добио Нобелову награду, испричаће нам сам Џејмс Вотсон, откривач молекула ДНК.
Одломак из књиге Џејмс Вотсон, Ендру Бери, Кевин Дејвис
ДНК. Историја генетске револуције
Поглавље 7. Људски геном. Животни сценарио
...
Ланчану реакцију полимеразе (ПЦР) измислио је 1983. биохемичар Кери Мулис, који је радио у Цетусу. Откриће ове реакције било је прилично значајно. Муллис се касније присећао: „Једног петка увече у априлу 1983. имао сам богојављење. Био сам за воланом, возећи се месечином обасјаним, кривудавим планинским путем у северној Калифорнији, земљи шума секвоје.” Импресивно је да га је управо у таквој ситуацији снашла инспирација. И није да северна Калифорнија има посебне путеве који промовишу увид; само што је његов пријатељ једном видео Муллиса како безобзирно јури по залеђеном двојном коловозу и то му уопште није сметало. Пријатељ је рекао за Њујорк тајмс: „Мулис је имао визију да ће умрети ударивши у дрво секвоје. Дакле, он се ничега не плаши док вози, осим ако поред пута не расте дрвеће секвоја.” Присуство секвоје дуж пута натерало је Мулиса да се концентрише и... ево га, увид. Муллис је 1993. године добио Нобелову награду за хемију за свој изум и од тада је постао још чуднији у својим поступцима. На пример, он је присталица ревизионистичке теорије да СИДА није повезана са ХИВ-ом, што је значајно нарушило његову репутацију и ометало рад лекара.
ПЦР је прилично једноставна реакција. Да бисмо то спровели, потребна су нам два хемијски синтетизована прајмера који су комплементарни супротним крајевима различитих ланаца потребног ДНК фрагмента. Прајмери су кратки делови једноланчане ДНК, сваки дужине око 20 парова база. Посебност прајмера је у томе што одговарају деловима ДНК које треба појачати, односно ДНК шаблону.
(На слику се може кликнути) Кари Муллис, проналазач ПЦР-а
Специфичност ПЦР-а заснива се на формирању комплементарних комплекса између шаблона и прајмера, кратких синтетичких олигонуклеотида. Сваки од прајмера је комплементаран једном од ланаца дволанчаног шаблона и ограничава почетак и крај амплификованог региона. У ствари, резултујућа „матрица“ је цео геном, а наш циљ је да из њега изолујемо фрагменте који нас занимају. Да би се то урадило, дволанчани ДНК шаблон се загрева на 95 °Ц неколико минута да би се одвојили ДНК ланци. Ова фаза се назива денатурација јер су водоничне везе између два ланца ДНК прекинуте. Када се праменови раздвоје, температура се снижава да би се прајмерима омогућило да се вежу за једноланчани шаблон. ДНК полимераза почиње репликацију ДНК везивањем за део нуклеотидног ланца. Ензим ДНК полимераза реплицира ланац шаблона користећи прајмер као прајмер или пример за копирање. Као резултат првог циклуса, добијамо вишеструко секвенцијално удвостручавање одређеног одељка ДНК. Затим понављамо ову процедуру. После сваког циклуса добијамо циљно подручје у двострукој количини. После двадесет пет ПЦР циклуса (то јест, за мање од два сата), имамо ДНК регион који нас занима у количини 225 пута већој од оригиналне (односно, појачали смо је приближно 34 милиона пута). У ствари, на улазу смо добили мешавину прајмера, шаблон ДНК, ензима ДНК полимеразе и слободних база А, Ц, Г и Т, количина специфичног реакционог производа (ограниченог прајмерима) експоненцијално расте, а број „дугих“ копија ДНК је линеаран, тако да у продуктима реакције доминира.
Амплификација жељене секције ДНК: ланчана реакција полимеразе
У првим данима ПЦР-а главни проблем је био следећи: после сваког циклуса загревања-хлађења, у реакциону смешу је морала да се дода ДНК полимераза, пошто је била инактивирана на температури од 95 °Ц. Због тога је било неопходно поново га додати пре сваког од 25 циклуса. Реакциона процедура је била релативно неефикасна, захтевала је доста времена и ензима полимеразе, а материјал је био веома скуп. Срећом, у помоћ је притекла мајка природа. Многе животиње се осећају пријатно на температурама много вишим од 37 °Ц. Зашто нам је цифра 37 °Ц постала важна? Ово се десило јер је ова температура оптимална за Е. цоли, из које је првобитно добијен ензим полимеразе за ПЦР. У природи постоје микроорганизми чији су протеини, током милиона година природне селекције, постали отпорнији на високе температуре. Предложено је коришћење ДНК полимераза из термофилних бактерија. Показало се да су ови ензими термостабилни и могли су да издрже многе реакционе циклусе. Њихова употреба је омогућила да се поједностави и аутоматизује ПЦР. Једна од првих термостабилних ДНК полимераза изолована је из бактерије Тхермус акуатицус, која живи у врелим изворима Националног парка Јелоустон, и названа је Так полимераза.
ПЦР је брзо постао радни коњ пројекта Хуман Геноме. Генерално, процес се не разликује од оног који је развио Муллис, управо је аутоматизован. Више нисмо зависили од гомиле глупих дипломираних студената који су мукотрпно сипали капљице течности у пластичне епрувете. У савременим лабораторијама које врше молекуларно-генетичка истраживања, овај посао се обавља на роботским транспортерима. ПЦР роботи укључени у пројекат секвенцирања великог као што је људски геном немилосрдно раде са огромним количинама топлотно стабилне полимеразе. Неки научници који раде на Пројекту за људски геном били су огорчени због неразумно високих хонорара које је власник ПЦР патента, европски индустријски фармацеутски гигант Хофман-Ларош, додао на цену потрошног материјала.
Други „покретачки принцип“ био је сам метод секвенцирања ДНК. Хемијска основа ове методе у то време више није била нова: Међудржавни пројекат људског генома (ХГП) усвојио је исти генијални метод који је Фред Сангер развио средином 1970-их. Иновација је била у обиму и степену аутоматизације које је секвенцирање било у стању да постигне.
Аутоматско секвенцирање је првобитно развијено у лабораторији Лее Хоода на Калифорнијском институту за технологију. Похађао је средњу школу у Монтани и играо колеџ фудбал као квотербек; Захваљујући Худу, тим је више пута освојио државно првенство. Његове вештине тимског рада су му такође добро дошле у научној каријери. У Худовој лабораторији радила је шаролика екипа хемичара, биолога и инжењера, а његова лабораторија је убрзо постала лидер у технолошким иновацијама.
У ствари, метод аутоматизованог секвенцирања су измислили Ллоид Смитх и Мике Хункапиллер. Мајк Ханкапилер, који је тада радио у Худовој лабораторији, обратио се Лојду Смиту са предлогом за побољшану методу секвенцирања у којој би свака врста базе била другачије обојена. Таква идеја би могла да учетворостручи ефикасност Сангеровог процеса. У Сангеру, при секвенцирању у свакој од четири епрувете (према броју база), уз учешће ДНК полимеразе, формира се јединствени скуп олигонуклеотида различите дужине, укључујући секвенцу прајмера. Затим је у епрувете додат формамид за раздвајање ланца и електрофореза у полиакриламидном гелу је изведена на четири траке. У Смит и Хункапилеровој верзији, дидеоксинуклеотиди су обележени са четири различите боје и ПЦР се изводи у једној епрувети. Затим, током електрофорезе у полиакриламидном гелу, ласерски зрак на одређеној локацији на гелу побуђује активност боја, а детектор одређује који нуклеотид тренутно мигрира кроз гел. У почетку, Смит је био песимистичан - плашио се да ће коришћење ултра-ниских доза боје довести до тога да се нуклеотидни региони не могу разликовати. Међутим, одлично разумевши ласерску технологију, убрзо је пронашао излаз из ситуације користећи посебне флуорохромне боје које флуоресцирају када су изложене ласерском зрачењу.
(Пуна верзија - 4,08 МБ) Фини испис: ДНК секвенца секвенционирана помоћу аутоматског секвенцера, добијеног из аутоматске машине за секвенцирање. Свака боја одговара једној од четири базе
У класичној верзији Сангерове методе, један од ланаца анализиране ДНК делује као шаблон за синтезу комплементарног ланца ензимом ДНК полимеразом, затим се секвенца ДНК фрагмената сортира у гелу по величини. Сваки фрагмент, који је укључен у ДНК током синтезе и омогућава накнадну визуализацију производа реакције, обележен је флуоресцентном бојом која одговара терминалној бази (о томе је било речи на стр. 124); стога ће флуоресценција овог фрагмента бити идентификатор за дату базу. Затим остаје само да се изврши детекција и визуализују производи реакције. Резултати су компјутерски анализирани и представљени као низ вишебојних пикова који одговарају четири нуклеотида. Информације се затим директно преносе у информациони систем рачунара, елиминишући дуготрајан и понекад болан процес уноса података који је отежавао секвенцирање.
» Више детаља о књизи можете пронаћи на
»
»
За Кхаброзхителеи 25% попуста користећи купон - PCR
Извор: ввв.хабр.цом