El premi Nobel nord-americà de química Kary Mullis va morir a Califòrnia als 74 anys. Segons la seva dona, la mort es va produir el 7 d'agost. La causa és la insuficiència cardíaca i respiratòria per pneumònia.
El mateix James Watson, el descobridor de la molècula d'ADN, ens explicarà la contribució que va fer a la bioquímica i per la qual va rebre el Premi Nobel.
Fragment del llibre de James Watson, Andrew Berry, Kevin Davis
ADN. Història de la revolució genètica
Capítol 7. Genoma humà. Escenari de vida
...
La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) va ser inventada l'any 1983 pel bioquímic Carey Mullis, que treballava a Cetus. El descobriment d'aquesta reacció va ser força notable. Mullis va recordar més tard: "Un divendres al vespre d'abril de 1983, vaig tenir una epifania. Estava al volant, conduint per una carretera de muntanya sinuosa i il·luminada per la lluna al nord de Califòrnia, la terra dels boscos de sequoies". És impressionant que va ser en aquesta situació quan la inspiració el va sorprendre. I no és que el nord de Califòrnia tingui carreteres especials que afavoreixin la visió; és que el seu amic una vegada va veure en Mullis accelerar de manera temerària per una autovia gelada i no li va molestar gens. Un amic va dir al New York Times: "Mullis va tenir la visió que moriria xocant contra un arbre de sequoia. Per tant, no té por de res mentre condueix, tret que hi hagi arbres de sequoia creixent al llarg de la carretera ". La presència de sequoies al llarg de la carretera va obligar Mullis a concentrar-se i... aquí estava, una visió. Mullis va rebre el Premi Nobel de Química pel seu invent el 1993 i des de llavors s'ha tornat encara més estrany en les seves accions. Per exemple, és partidari de la teoria revisionista que la sida no està relacionada amb el VIH, que va soscavar significativament la seva pròpia reputació i interferir amb els metges.
La PCR és una reacció bastant senzilla. Per dur-ho a terme necessitem dos cebadors sintetitzats químicament que siguin complementaris als extrems oposats de diferents cadenes del fragment d'ADN requerit. Els cebadors són seccions curtes d'ADN monocatenari, cadascuna d'uns 20 parells de bases de longitud. La particularitat dels cebadors és que corresponen a les seccions d'ADN que cal amplificar, és a dir, la plantilla d'ADN.
(Imatge clicable) Kary Mullis, inventor de la PCR
L'especificitat de la PCR es basa en la formació de complexos complementaris entre la plantilla i els primers, oligonucleòtids sintètics curts. Cadascun dels primers és complementari a una de les cadenes de la plantilla de doble cadena i limita l'inici i el final de la regió amplificada. De fet, la "matriu" resultant és tot un genoma, i el nostre objectiu és aïllar-ne els fragments que ens interessen. Per fer-ho, la plantilla d'ADN de doble cadena s'escalfa a 95 °C durant uns quants minuts per separar les cadenes d'ADN. Aquesta etapa s'anomena desnaturalització perquè els enllaços d'hidrogen entre les dues cadenes d'ADN es trenquen. Un cop les cadenes s'han separat, la temperatura es redueix per permetre que els primers s'uneixin a la plantilla monocatenària. L'ADN polimerasa comença la replicació de l'ADN unint-se a un tram de cadena de nucleòtids. L'enzim ADN polimerasa replica la cadena de plantilla utilitzant un cebador com a cebador o exemple per a la còpia. Com a resultat del primer cicle, obtenim una duplicació seqüencial múltiple d'una determinada secció d'ADN. A continuació repetim aquest procediment. Després de cada cicle obtenim una àrea objectiu en quantitat doble. Després de vint-i-cinc cicles de PCR (és a dir, en menys de dues hores), tenim la regió d'ADN que ens interessa en una quantitat 225 vegades superior a l'original (és a dir, l'hem amplificat aproximadament 34 milions de vegades). De fet, a l'entrada vam rebre una barreja de cebadors, ADN plantilla, l'enzim ADN polimerasa i bases lliures A, C, G i T, la quantitat d'un producte de reacció específic (limitat pels cebadors) creix de manera exponencial i el nombre de còpies d'ADN "llargues" és lineal, de manera que predominen els productes de reacció.
Amplificació de la secció d'ADN desitjada: reacció en cadena de la polimerasa
En els primers dies de la PCR, el principal problema era el següent: després de cada cicle d'escalfament-refrigerament, s'havia d'afegir ADN polimerasa a la mescla de reacció, ja que s'inactivava a una temperatura de 95 °C. Per tant, va ser necessari tornar-lo a afegir abans de cadascun dels 25 cicles. El procediment de reacció era relativament ineficient, requeria molt de temps i l'enzim polimerasa, i el material era molt car. Per sort, la mare natura va venir al rescat. Molts animals se senten còmodes a temperatures molt superiors als 37 °C. Per què la xifra de 37 °C es va fer important per a nosaltres? Això va passar perquè aquesta temperatura és òptima per a E. coli, de la qual es va obtenir originalment l'enzim polimerasa per a la PCR. A la natura hi ha microorganismes les proteïnes dels quals, al llarg de milions d'anys de selecció natural, s'han tornat més resistents a les altes temperatures. S'ha proposat utilitzar ADN polimerases de bacteris termòfils. Aquests enzims van resultar ser termoestables i van poder suportar molts cicles de reacció. El seu ús va permetre simplificar i automatitzar la PCR. Una de les primeres ADN polimerases termoestables es va aïllar del bacteri Thermus aquaticus, que viu a les aigües termals del Parc Nacional de Yellowstone, i es va anomenar Taq polimerasa.
La PCR es va convertir ràpidament en el cavall de batalla del Projecte Genoma Humà. En general, el procés no és diferent del desenvolupat per Mullis, s'acaba d'automatitzar. Ja no depeníem d'una multitud d'estudiants de postgrau cecs que aboquessin minuciosament gotes de líquid en tubs d'assaig de plàstic. En els laboratoris moderns que duen a terme investigacions genètiques moleculars, aquest treball es realitza en transportadors robòtics. Els robots de PCR que treballen en un projecte de seqüenciació tan gran com el genoma humà treballen sense parar amb grans volums de polimerasa estable a la calor. Alguns científics que treballen en el Projecte del genoma humà es van indignar per les royalties extraordinàriament altes que s'afegeixen al cost dels consumibles pel propietari de la patent de PCR, el gegant farmacèutic industrial europeu Hoffmann-LaRoche.
Un altre "principi conductor" va ser el propi mètode de seqüenciació de l'ADN. La base química d'aquest mètode ja no era nova en aquell moment: el Projecte Interstate Human Genome (HGP) va adoptar el mateix mètode enginyós que Fred Sanger havia desenvolupat a mitjans dels anys setanta. La innovació rau en l'escala i el grau d'automatització que la seqüenciació va poder aconseguir.
La seqüenciació automatitzada es va desenvolupar originalment al laboratori de Lee Hood a l'Institut Tecnològic de Califòrnia. Va assistir a l'escola secundària a Montana i va jugar a futbol universitari com a quarterback; Gràcies a Hood, l'equip va guanyar el campionat estatal més d'una vegada. Les seves habilitats de treball en equip també van ser útils en la seva carrera científica. El laboratori de Hood comptava amb un equip variat de químics, biòlegs i enginyers, i el seu laboratori aviat es va convertir en un líder en innovació tecnològica.
De fet, el mètode de seqüenciació automatitzat va ser inventat per Lloyd Smith i Mike Hunkapiller. Mike Hunkapiller, que aleshores treballava al laboratori de Hood, es va apropar a Lloyd Smith amb una proposta per a un mètode de seqüenciació millorat en què cada tipus de base tindria un color diferent. Una idea així podria quadruplicar l'eficiència del procés Sanger. A Sanger, en seqüenciar en cadascun dels quatre tubs (segons el nombre de bases), amb la participació de l'ADN polimerasa, es forma un conjunt únic d'oligonucleòtids de diferents longituds, inclosa una seqüència d'encebadors. A continuació, es va afegir formamida als tubs per a la separació de la cadena i es va realitzar una electroforesi en gel de poliacrilamida en quatre carrils. En la versió de Smith i Hunkapiller, els didesoxinucleòtids s'etiqueten amb quatre colorants diferents i es realitza la PCR en un tub. Aleshores, durant l'electroforesi en gel de poliacrilamida, un raig làser en una ubicació específica del gel excita l'activitat dels colorants i el detector determina quin nucleòtid està migrant actualment a través del gel. Al principi, Smith era pessimista: temia que l'ús de dosis molt baixes de colorant fes que les regions de nucleòtids fossin indistinguibles. No obstant això, tenint una excel·lent comprensió de la tecnologia làser, aviat va trobar una manera de sortir de la situació mitjançant l'ús de colorants especials de fluorocrom que fan fluorescència quan s'exposa a la radiació làser.
(Versió completa - 4,08 MB) Lletra petita: seqüència d'ADN seqüenciada mitjançant un seqüenciador automàtic, obtinguda a partir d'una màquina de seqüenciació automàtica. Cada color correspon a una de les quatre bases
En la versió clàssica del mètode Sanger, una de les cadenes de l'ADN analitzat actua com a plantilla per a la síntesi d'una cadena complementària per part de l'enzim DNA polimerasa, després la seqüència de fragments d'ADN s'ordena en un gel per mida. Cada fragment, que s'inclou a l'ADN durant la síntesi i permet la visualització posterior dels productes de la reacció, està marcat amb un colorant fluorescent corresponent a la base terminal (això es va comentar a la pàg. 124); per tant, la fluorescència d'aquest fragment serà un identificador per a una base determinada. Aleshores només queda realitzar la detecció i visualitzar els productes de reacció. Els resultats s'analitzen per ordinador i es presenten com una seqüència de pics multicolors corresponents a quatre nucleòtids. Aleshores, la informació es transfereix directament al sistema d'informació de l'ordinador, eliminant el procés d'entrada de dades que requereix molt de temps i de vegades dolorós que dificulta molt la seqüenciació.
» Podeu trobar més detalls sobre el llibre a
»
»
Per a Khabrozhiteley 25% de descompte amb cupó - PCR
Font: www.habr.com