ProHoster > Blogs > interneta ziņas > Nobela prēmijas laureāts Karijs Mulliss, DNS polimerāzes ķēdes reakcijas izgudrotājs, ir miris

Nobela prēmijas laureāts Karijs Mulliss, DNS polimerāzes ķēdes reakcijas izgudrotājs, ir miris

Nobela prēmijas laureāts Karijs Mulliss, DNS polimerāzes ķēdes reakcijas izgudrotājs, ir miris Kalifornijā 74 gadu vecumā miris amerikāņu Nobela prēmijas laureāts Ä·Ä«mijā Karijs Muliss. Pēc sievas teiktā, nāve iestājusies 7.augustā. Cēlonis ir sirds un elpoÅ”anas mazspēja pneimonijas dēļ.

Pats Džeimss Vatsons, DNS molekulas atklājējs, pastāstÄ«s par viņa ieguldÄ«jumu bioÄ·Ä«mijā un par ko viņŔ saņēma Nobela prēmiju.

Fragments no Džeimsa Vatsona, Endrjū Berija, Kevina Deivisa grāmatas

DNS. Ģenētiskās revolūcijas vēsture

7. nodaļa. Cilvēka genoms. Dzīves scenārijs


...
Polimerāzes ķēdes reakciju (PCR) 1983. gadā izgudroja bioÄ·Ä«miÄ·is Kerijs Mulliss, kurÅ” strādāja uzņēmumā Cetus. Å Ä«s reakcijas atklāŔana bija diezgan ievērojama. Mullis vēlāk atcerējās: ā€Kādu piektdienas vakaru 1983. gada aprÄ«lÄ« man bija epifānija. Es sēdēju pie stÅ«res un braucu pa mēness apspÄ«dētu, lÄ«kumotu kalnu ceļu Ziemeļkalifornijā, sekvoju mežu zemē. IespaidÄ«gi, ka tieÅ”i Ŕādā situācijā viņu pārsteidza iedvesma. Un nav tā, ka Kalifornijas ziemeļos ir Ä«paÅ”i ceļi, kas veicina ieskatu; vienkārÅ”i viņa draugs reiz redzēja, kā Mullis neapdomÄ«gi traucās pa apledojuÅ”u dubultu brauktuvi un tas viņu nemaz netraucēja. Kāds draugs laikrakstam New York Times stāstÄ«ja: ā€œMullisam bija vÄ«zija, ka viņŔ nomirs, ietriecoties sarkankokā. Tāpēc viņŔ ne no kā nebaidās braucot, ja vien gar ceļu neaug sekvojumi.Ā» Sevojas klātbÅ«tne gar ceļu lika Mulsam koncentrēties un... lÅ«k, ieskats. Mullis saņēma Nobela prēmiju Ä·Ä«mijā par savu izgudrojumu 1993. gadā un kopÅ” tā laika ir kļuvis vēl dÄ«vaināks savā darbÄ«bā. Piemēram, viņŔ atbalsta revizionisma teoriju, ka AIDS nav saistÄ«ta ar HIV, kas bÅ«tiski iedragāja viņa paÅ”a reputāciju un traucēja ārstiem.

PCR ir diezgan vienkārÅ”a reakcija. Lai to Ä«stenotu, mums ir nepiecieÅ”ami divi Ä·Ä«miski sintezēti praimeri, kas ir komplementāri vajadzÄ«gā DNS fragmenta dažādu virkņu pretējiem galiem. Praimeri ir Ä«sas vienpavedienu DNS daļas, katra aptuveni 20 bāzes pāru garumā. Praimeru Ä«patnÄ«ba ir tāda, ka tie atbilst DNS sekcijām, kuras ir jāpastiprina, tas ir, DNS veidnei.

Nobela prēmijas laureāts Karijs Mulliss, DNS polimerāzes ķēdes reakcijas izgudrotājs, ir miris
(Attēls ir noklikŔķināms) Kary Mullis, PCR izgudrotājs

PCR specifika ir balstÄ«ta uz komplementāru kompleksu veidoÅ”anos starp Å”ablonu un praimeriem, Ä«siem sintētiskiem oligonukleotÄ«diem. Katrs primer papildina vienu no divpavedienu veidnes pavedieniem un ierobežo pastiprinātā reÄ£iona sākumu un beigas. Faktiski iegÅ«tā ā€œmatricaā€ ir vesels genoms, un mÅ«su mērÄ·is ir no tā izolēt mÅ«s interesējoÅ”os fragmentus. Lai to izdarÄ«tu, divpavedienu DNS veidni vairākas minÅ«tes karsē lÄ«dz 95 Ā°C, lai atdalÄ«tu DNS virknes. Å o posmu sauc par denaturāciju, jo Å«deņraža saites starp abām DNS virknēm ir pārrautas. Kad pavedieni ir atdalÄ«juÅ”ies, temperatÅ«ra tiek pazemināta, lai ļautu gruntskrāsām piesaistÄ«ties vienpavediena veidnei. DNS polimerāze sāk DNS replikāciju, saistoties ar nukleotÄ«du ķēdes posmu. Fermenta DNS polimerāze replikē veidnes virkni, izmantojot praimeri kā praimeri vai piemēru kopÄ“Å”anai. Pirmā cikla rezultātā mēs iegÅ«stam noteiktas DNS sekcijas vairākkārtēju secÄ«gu dubultoÅ”anu. Tālāk mēs atkārtojam Å”o procedÅ«ru. Pēc katra cikla mēs iegÅ«stam mērÄ·a apgabalu dubultā daudzumā. Pēc divdesmit pieciem PCR cikliem (tas ir, mazāk nekā divās stundās) mums interesējoÅ”ais DNS reÄ£ions ir 225 reizes lielāks nekā oriÄ£ināls (tas ir, mēs to esam pastiprinājuÅ”i aptuveni 34 miljonus reižu). Faktiski ievades laikā mēs saņēmām praimeru, Å”ablona DNS, DNS polimerāzes enzÄ«ma un brÄ«vo bāzu A, C, G un T maisÄ«jumu, specifiskā reakcijas produkta daudzums (ierobežots ar praimeriem) pieaug eksponenciāli, un garasā€ DNS kopijas ir lineāras, tāpēc dominē reakcijas produkti.

Nobela prēmijas laureāts Karijs Mulliss, DNS polimerāzes ķēdes reakcijas izgudrotājs, ir miris
Vēlamās DNS sekcijas pastiprināŔana: polimerāzes ķēdes reakcija

PCR pirmajās dienās galvenā problēma bija Ŕāda: pēc katra sildÄ«Å”anas-dzesÄ“Å”anas cikla reakcijas maisÄ«jumam bija jāpievieno DNS polimerāze, jo tā tika inaktivēta 95 Ā° C temperatÅ«rā. Tāpēc bija nepiecieÅ”ams to atkārtoti pievienot pirms katra no 25 cikliem. Reakcijas procedÅ«ra bija salÄ«dzinoÅ”i neefektÄ«va, prasÄ«ja daudz laika un polimerāzes enzÄ«ma, un materiāls bija ļoti dārgs. Par laimi, māte daba nāca palÄ«gā. Daudzi dzÄ«vnieki jÅ«tas ērti, ja temperatÅ«ra ir daudz augstāka par 37 Ā°C. Kāpēc skaitlis 37 Ā°C mums kļuva svarÄ«gs? Tas notika tāpēc, ka Ŕī temperatÅ«ra ir optimāla E. coli, no kuras sākotnēji tika iegÅ«ts polimerāzes enzÄ«ms PCR. Dabā ir mikroorganismi, kuru proteÄ«ni miljoniem gadu dabiskās atlases laikā ir kļuvuÅ”i izturÄ«gāki pret augstām temperatÅ«rām. Ir ierosināts izmantot termofÄ«lo baktēriju DNS polimerāzes. Å ie fermenti izrādÄ«jās termostabÄ«li un spēja izturēt daudzus reakcijas ciklus. To izmantoÅ”ana ļāva vienkārÅ”ot un automatizēt PCR. Viena no pirmajām termostabilajām DNS polimerāzēm tika izolēta no baktērijas Thermus aquaticus, kas dzÄ«vo Jeloustonas nacionālā parka karstajos avotos, un tika nosaukta par Taq polimerāzi.

PCR ātri kļuva par cilvēka genoma projekta darba zirgu. Kopumā process ne ar ko neatŔķiras no Mullis izstrādātā, nupat tas ir automatizēts. Mēs vairs nebijām atkarÄ«gi no vājprātÄ«gu absolventu pūļa, kas cÄ«tÄ«gi lej Ŕķidruma pilienus plastmasas mēģenēs. MÅ«sdienu laboratorijās, kas veic molekulāro Ä£enētisko izpēti, Å”is darbs tiek veikts uz robotizētiem konveijeriem. PCR roboti, kas iesaistÄ«ti sekvencÄ“Å”anas projektā, kas ir tik liels kā Cilvēka genoms, neatlaidÄ«gi strādā ar milzÄ«giem karstumizturÄ«gas polimerāzes apjomiem. Daži zinātnieki, kas strādā pie Cilvēka genoma projekta, bija saÅ”utuÅ”i par nepamatoti augstajiem honorāriem, ko palÄ«gmateriālu izmaksām pievienoja PCR patenta Ä«paÅ”nieks, Eiropas rÅ«pnieciskās farmācijas gigants Hoffmann-LaRoche.

Vēl viens ā€œvadÄ«Å”anas principsā€ bija pati DNS sekvencÄ“Å”anas metode. Å Ä«s metodes Ä·Ä«miskā bāze tajā laikā vairs nebija jauna: starpvalstu cilvēka genoma projekts (HGP) pieņēma to paÅ”u Ä£eniālo metodi, ko Freds Sangers bija izstrādājis 1970. gadu vidÅ«. Inovācija slēpjas automatizācijas mērogā un pakāpē, ko varēja sasniegt sekvencÄ“Å”ana.

Automatizētā sekvencÄ“Å”ana sākotnēji tika izstrādāta LÄ« Huda laboratorijā Kalifornijas TehnoloÄ£iju institÅ«tā. ViņŔ apmeklēja vidusskolu Montānā un spēlēja koledžas futbolu kā aizsargs; Pateicoties Hudam, komanda ne reizi vien uzvarēja valsts čempionātā. Viņa komandas darba prasmes noderēja arÄ« viņa zinātniskajā karjerā. Huda laboratorijā strādāja raiba Ä·Ä«miÄ·u, biologu un inženieru komanda, un viņa laboratorija drÄ«z kļuva par tehnoloÄ£isko inovāciju lÄ«deri.

Faktiski automatizēto sekvencÄ“Å”anas metodi izgudroja Loids Smits un Maiks Hunkapillers. Maiks Hunkapillers, kurÅ” toreiz strādāja Huda laboratorijā, vērsās pie Loida Smita ar priekÅ”likumu par uzlabotu sekvencÄ“Å”anas metodi, kurā katrs bāzes veids tiktu krāsots atŔķirÄ«gi. Šāda ideja varētu četrkārÅ”ot Sanger procesa efektivitāti. Sangerā, veicot sekvencÄ“Å”anu katrā no četrām mēģenēm (pēc bāzu skaita), piedaloties DNS polimerāzei, veidojas unikāls dažāda garuma oligonukleotÄ«du kopums, ieskaitot praimeru secÄ«bu. Pēc tam mēģenēm tika pievienots formamÄ«ds ķēdes atdalÄ«Å”anai, un četrās joslās tika veikta poliakrilamÄ«da gēla elektroforēze. Smith un Hunkapiller versijā dideoksinukleotÄ«di ir marķēti ar četrām dažādām krāsvielām, un PCR tiek veikta vienā mēģenē. Pēc tam poliakrilamÄ«da gēla elektroforēzes laikā lāzera stars noteiktā vietā uz gēla ierosina krāsvielu aktivitāti, un detektors nosaka, kurÅ” nukleotÄ«ds paÅ”laik migrē caur gēlu. Sākumā Smits bija pesimistisks - viņŔ baidÄ«jās, ka ļoti zemu krāsvielu devu izmantoÅ”ana novedÄ«s pie tā, ka nukleotÄ«du reÄ£ionus nevarēs atŔķirt. Taču, lieliski pārzinot lāzertehnoloÄ£iju, viņŔ drÄ«z vien atrada izeju no situācijas, izmantojot Ä«paÅ”as fluorohroma krāsvielas, kas fluorescē, pakļaujoties lāzera starojumam.

Nobela prēmijas laureāts Karijs Mulliss, DNS polimerāzes ķēdes reakcijas izgudrotājs, ir miris
(Pilna versija ar klikŔķi - 4,08 MB) SÄ«kā druka: DNS sekvencÄ“Å”ana, kas sekvencēta, izmantojot automātisko sekvencētāju, iegÅ«ta no automātiskās sekvencÄ“Å”anas iekārtas. Katra krāsa atbilst vienai no četrām bāzēm

Klasiskajā Sanger metodes versijā viena no analizētās DNS virknēm darbojas kā veidne komplementāras virknes sintēzei ar enzÄ«mu DNS polimerāzi, pēc tam DNS fragmentu secÄ«ba tiek sakārtota gēlā pēc izmēra. Katrs fragments, kas ir iekļauts DNS sintēzes laikā un ļauj vēlāk vizualizēt reakcijas produktus, tiek marķēts ar fluorescējoÅ”u krāsvielu, kas atbilst gala bāzei (par to tika runāts 124. lpp.); tādēļ Ŕī fragmenta fluorescence bÅ«s noteiktas bāzes identifikators. Tad atliek tikai veikt noteikÅ”anu un vizualizēt reakcijas produktus. Rezultāti tiek analizēti ar datoru un parādÄ«ti kā daudzkrāsainu pÄ«Ä·u secÄ«ba, kas atbilst četriem nukleotÄ«diem. Pēc tam informācija tiek pārsÅ«tÄ«ta tieÅ”i uz datora informācijas sistēmu, novērÅ”ot laikietilpÄ«go un dažkārt sāpÄ«go datu ievades procesu, kas ļoti sarežģīja secÄ«bu noteikÅ”anu.

Ā» SÄ«kāku informāciju par grāmatu var atrast vietnē izdevēja vietne
Ā» Satura
Ā» Izraksts

Par Khabrozhiteley 25% atlaide, izmantojot kuponu - PCR

Avots: www.habr.com

Pievieno komentāru