美国诺贝尔化学奖得主卡里·穆利斯在加利福尼亚州去世，享年 74 岁。 据他的妻子称，死亡发生于7月XNUMX日。 原因是肺炎引起的心脏和呼吸衰竭。
DNA 分子的发现者詹姆斯·沃森本人将向我们讲述他对生物化学的贡献并因此获得诺贝尔奖。
摘自詹姆斯·沃森、安德鲁·贝里、凯文·戴维斯所著的书
脱氧核糖核酸。 基因革命的历史
第 7 章人类基因组。 生活场景
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聚合酶链式反应 (PCR) 是由在 Cetus 工作的生物化学家 Carey Mullis 于 1983 年发明的。 这个反应的发现是相当了不起的。 穆利斯后来回忆道：“1983 年 1993 月的一个星期五晚上，我顿悟了。 我坐在方向盘后面，沿着月光下、蜿蜒的山路行驶在北加州红杉林的土地上。” 令人印象深刻的是，他就是在这样的情况下获得了灵感。 这并不是说北加州有特殊的道路可以促进洞察力；而是因为北加州有特殊的道路可以促进洞察力。 只是他的朋友曾经看到穆利斯在结冰的双车道上鲁莽地超速行驶，但他对此一点也不介意。 一位朋友告诉《纽约时报》：“穆利斯有一个幻象，他会撞到一棵红杉树上而死。 所以，他开车时什么都不怕，除非路边长着红杉树。” 路边的红杉树迫使穆利斯集中注意力……这就是一个洞察力。 穆利斯因其发明于 XNUMX 年获得诺贝尔化学奖，此后他的行为变得更加奇怪。 例如，他是艾滋病与艾滋病毒无关的修正主义理论的支持者，这极大地损害了他自己的声誉并干扰了医生。
PCR 是一个相当简单的反应。 为了实现这一点，我们需要两个化学合成的引物，它们与所需 DNA 片段不同链的相对末端互补。 引物是单链 DNA 的短片段，每条长度约 20 个碱基对。 引物的特殊之处在于它们对应于需要扩增的DNA片段，即DNA模板。
（图片可点击）Kary Mullis，PCR 发明者
PCR 的特异性基于模板和引物（短的合成寡核苷酸）之间形成的互补复合物。 每个引物与双链模板的一条链互补，并限制扩增区域的开始和结束。 事实上，由此产生的“矩阵”是整个基因组，我们的目标是从中分离出我们感兴趣的片段。 为此，将双链 DNA 模板加热至 95 °C 几分钟以分离 DNA 链。 这个阶段称为变性，因为两条 DNA 链之间的氢键被破坏。 一旦链分离，就降低温度以使引物与单链模板结合。 DNA 聚合酶通过与一段核苷酸链结合开始 DNA 复制。 DNA聚合酶使用引物作为复制的引物或示例来复制模板链。 第一个循环的结果是，我们获得了某个 DNA 片段的多次连续加倍。 接下来我们重复这个过程。 每个周期后，我们都会获得双倍数量的目标区域。 经过 225 个 PCR 循环（即不到两小时），我们感兴趣的 DNA 区域的数量比原始区域高出 34 倍（即我们将其扩增了约 XNUMX 万倍）。 事实上，在输入时，我们收到了引物、模板 DNA、DNA 聚合酶和游离碱基 A、C、G 和 T 的混合物，特定反应产物的量（受引物限制）呈指数增长，并且数量呈指数增长。 “长”DNA 拷贝的数量是线性的，因此反应产物占主导地位。
所需 DNA 片段的扩增：聚合酶链式反应
在 PCR 的早期，主要问题如下：在每次加热-冷却循环后，必须将 DNA 聚合酶添加到反应混合物中，因为它在 95°C 的温度下会失活。 因此，有必要在25个循环之前重新添加。 反应过程效率相对较低，需要大量的时间和聚合酶，而且材料非常昂贵。 幸运的是，大自然母亲来救援了。 许多动物在远高于 37°C 的温度下会感到舒适。 为什么 37°C 这个数字对我们来说变得很重要？ 发生这种情况是因为这个温度对于大肠杆菌来说是最佳温度，而 PCR 聚合酶最初就是从大肠杆菌中获得的。 自然界中存在一些微生物，其蛋白质经过数百万年的自然选择，变得更加耐高温。 有人建议使用来自嗜热细菌的DNA聚合酶。 这些酶被证明是热稳定的，能够承受许多反应周期。 它们的使用使得 PCR 的简化和自动化成为可能。 第一个耐热 DNA 聚合酶是从生活在黄石国家公园温泉中的水生栖热菌中分离出来的，被命名为 Taq 聚合酶。
PCR 很快成为人类基因组计划的主力。 总的来说，这一过程与穆利斯开发的过程没有什么不同，只是实现了自动化。 我们不再依赖一群愚蠢的研究生辛苦地将液滴倒入塑料试管中。 在进行分子遗传学研究的现代实验室中，这项工作是在机器人传送带上进行的。 参与人类基因组这样规模的测序项目的 PCR 机器人不断地使用大量热稳定聚合酶。 一些从事人类基因组计划的科学家对 PCR 专利所有者、欧洲工业制药巨头霍夫曼-拉罗氏公司在消耗品成本上增加的不合理的高额特许权使用费感到愤怒。
另一个“驱动原理”是 DNA 测序方法本身。 这种方法的化学基础在当时已不再新鲜：州际人类基因组计划 (HGP) 采用了 Fred Sanger 在 1970 世纪 XNUMX 年代中期开发的相同巧妙方法。 创新在于测序能够实现的自动化规模和程度。
自动测序最初是在加州理工学院的 Lee Hood 实验室开发的。 他在蒙大拿州上高中，并在大学担任四分卫。 感谢胡德，球队不止一次获得州冠军。 他的团队合作能力在他的科学生涯中也派上了用场。 胡德的实验室由化学家、生物学家和工程师组成，他的实验室很快成为技术创新的领导者。
事实上，自动测序方法是由 Lloyd Smith 和 Mike Hunkapiller 发明的。 当时在胡德实验室工作的迈克·亨卡皮勒 (Mike Hunkapiller) 向劳埃德·史密斯提出了一项改进测序方法的建议，其中每种类型的碱基都会有不同的颜色。 这样的想法可以使桑格过程的效率提高四倍。 在Sanger中，当在四个试管中的每一个中进行测序时（根据碱基数量），在DNA聚合酶的参与下，形成一组独特的不同长度的寡核苷酸，包括引物序列。 接下来，向管中添加甲酰胺进行链分离，并在四个泳道上进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。 在 Smith 和 Hunkapiller 的版本中，双脱氧核苷酸用四种不同的染料标记，并且 PCR 在一根管中进行。 然后，在聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，凝胶上特定位置的激光束激发染料的活性，检测器确定当前正在凝胶中迁移的核苷酸。 起初，史密斯很悲观——他担心使用超低剂量的染料会导致核苷酸区域无法区分。 然而，由于对激光技术有深入的了解，他很快就找到了摆脱这种情况的方法，即使用特殊的荧光染料，这种染料在受到激光辐射时会发出荧光。
（完整版 - 4,08 MB) 小字：使用自动测序仪测序的 DNA 序列，从自动测序机获得。 每种颜色对应四种碱基之一
在桑格方法的经典版本中，被分析的 DNA 的一条链充当 DNA 聚合酶合成互补链的模板，然后在凝胶中按大小对 DNA 片段的序列进行排序。 每个片段在合成过程中包含在 DNA 中，并允许随后可视化反应产物，并用与末端碱基相对应的荧光染料进行标记（这已在第 124 页讨论过）； 因此，该片段的荧光将是给定碱基的标识符。 然后剩下的就是进行检测并可视化反应产物。 结果通过计算机进行分析并呈现为对应于四个核苷酸的多色峰序列。 然后，信息将直接传输到计算机的信息系统，从而消除了耗时且有时令人痛苦的数据输入过程，该过程使排序变得非常困难。
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来源： habr.com